唐碩 魏強(qiáng) 王安果 張宗平 文焰林 李云祥

組織蛋白酶B在膀胱移形細(xì)胞癌中表達(dá)與復(fù)發(fā)的相關(guān)性*

唐碩1魏強(qiáng)2王安果1張宗平1文焰林1李云祥1

(1.川北醫(yī)學(xué)院第二臨床醫(yī)學(xué)院·南充市中心醫(yī)院泌尿外科, 四川 南充637000；

2.四川大學(xué)華西醫(yī)院泌尿外科， 四川 成都 610041)

目的 探討組織蛋白酶B(CB)在膀胱移行細(xì)胞癌(BTCC)組織中的表達(dá)及與腫瘤復(fù)發(fā)的關(guān)系。方法 收集1994～2011年復(fù)發(fā)的膀胱移形細(xì)胞癌標(biāo)本，共計(jì)病理組織切片172份，用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法行CB免疫組織化學(xué)染色并計(jì)算CB陽(yáng)性細(xì)胞百分率。 結(jié)果 癌組織中CB陽(yáng)性細(xì)胞以彌散分布為主,細(xì)胞周圍基質(zhì)染色明顯。BTCC組織中CB標(biāo)記指數(shù)(21.53±4.27)較正常組織(0.34±0.18)明顯升高(P<0.05)；高分級(jí)癌組織中CB標(biāo)記指數(shù)(27.25±4.82)較低分級(jí)(14.38±5.83)明顯增高(P<0.05)；復(fù)發(fā)組隨復(fù)發(fā)次數(shù)進(jìn)一步增高(P<0.05)；分期高的癌組織中CB值(24.68±5.42)較低期癌組織中(17.24±6.23)明顯升高(P<0.05)。結(jié)論 組織蛋白酶B在正常膀胱粘膜中幾乎不染色或僅見少許零星的陽(yáng)性細(xì)胞，在分級(jí)和分期高的癌組織中染色明顯，多為彌散陽(yáng)性染色,CB可作為判斷BTCC患者的進(jìn)展和預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。

組織蛋白酶B; 膀胱移形細(xì)胞癌; 復(fù)發(fā); 免疫組化

腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)示著腫瘤細(xì)胞的活動(dòng), 復(fù)發(fā)與轉(zhuǎn)移是關(guān)注的焦點(diǎn), 惡性腫瘤的復(fù)發(fā)顯示了腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)活動(dòng)，復(fù)發(fā)本身就是對(duì)患者的直接損害，不僅如此，腫瘤細(xì)胞的動(dòng)態(tài)活動(dòng)還預(yù)示著腫瘤的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移。組織蛋白酶B(CB)在多種惡性腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)并與侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)。本研究通過(guò)免疫組織化學(xué)方法,檢測(cè)CB在復(fù)發(fā)性膀胱癌中的表達(dá),探討其與膀胱移行細(xì)胞癌(BTCC)復(fù)發(fā)以及不同的病理分級(jí)，臨床分期之間的關(guān)系，從而為膀胱移行細(xì)胞癌的早期診斷，腫瘤進(jìn)展，腫瘤復(fù)發(fā)，惡性程度評(píng)估，以及預(yù)后提供重要的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來(lái)源 收集1994～2006年76例復(fù)發(fā)膀胱移形細(xì)胞癌標(biāo)本病理組織172份。其中男57例，女19例，年齡28～81歲，平均58.9歲。其中，123例次行TUR-Bt術(shù)，18例次行膀胱部分切除術(shù)，31例次行根治性膀胱切除術(shù)。所有患者術(shù)前均未行全身藥物化療、放射治療以及免疫生物治療。172份病理標(biāo)本按WHO新病理標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)：低級(jí)別腫瘤92例，高級(jí)別腫瘤80例。另取16例正常膀胱粘膜作為正常對(duì)照。

1.2 檢測(cè)方法 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶連接法(SP 法)，取各組組織石蠟切片，常規(guī)二甲苯脫蠟，乙醇水化。用蒸餾水新鮮配置3%H2O2-甲醇液去除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，然后用正常兔血清封閉。用 1∶200兔抗人CB (武漢博士德生物工程有限公司)作為一抗，滴加后 4 ℃過(guò)夜；次日滴加羊抗兔 IgG 作為二抗，作用 60 min，與鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶復(fù)合物培養(yǎng) 30 min。二氧基聯(lián)苯胺顯色，蘇木精復(fù)染。二抗試劑盒由美國(guó)ZYMED公司生產(chǎn)。每次試驗(yàn)均設(shè)置陰性對(duì)照，以磷酸鹽緩沖液代替一抗，結(jié)果顯示陰性。在在高倍鏡下每一組織切片中隨機(jī)選擇 10 個(gè)區(qū)域，共計(jì)數(shù) 2 000 個(gè)細(xì)胞，計(jì)算 CB 陽(yáng)性細(xì)胞百分比。CB 陽(yáng)性細(xì)胞為細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核呈棕色，顆粒狀或彌散狀染色，其余則為陰性細(xì)胞。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS11.5軟件，數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，應(yīng)用方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

組織蛋白酶B 在癌組織中可為細(xì)胞核染色,還可同時(shí)伴有基質(zhì)染色,基質(zhì)染色可在組織蛋白酶B 陽(yáng)性細(xì)胞周圍,也可表現(xiàn)為腫瘤細(xì)胞單純基質(zhì)染色，并且在腫瘤細(xì)胞周邊部染色更明顯。在正常膀胱組織中基質(zhì)無(wú)著色。組織蛋白酶B 陽(yáng)性細(xì)胞分布于BTCC的自基層到表層的所有層中,其標(biāo)記指數(shù)與切片腫瘤分級(jí)、分期密切相關(guān)，根據(jù)相關(guān)臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)也與腫瘤復(fù)發(fā)密切相關(guān)。

將膀胱癌組織與正常組織進(jìn)行組織蛋白酶B表達(dá)的比較發(fā)現(xiàn)正常組織中16例組織蛋白酶B陽(yáng)性，組織蛋白酶B陽(yáng)性細(xì)胞率(0.34±0.18)%，而在癌組織中卻可見到明顯的表達(dá)，172例陽(yáng)性，組織蛋白酶B陽(yáng)性細(xì)胞率(21.53±4.27)%，較正常組織明顯升高(P<0.05)。

病理分級(jí)中，高分級(jí)癌組織中組織蛋白酶B標(biāo)記指數(shù)較低分級(jí)明顯增高，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。通過(guò)對(duì)復(fù)發(fā)組與原發(fā)組的比較，發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)發(fā)次數(shù)的增加其表達(dá)會(huì)進(jìn)一步增強(qiáng)，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 BTCC組織中組織蛋白酶B與病理分級(jí)的關(guān)系

Table 1 The relationship of cathepsin B and pathological grading in BTCC tissues

BTCC病理n組織蛋白酶B陽(yáng)性細(xì)胞低級(jí)9214.38±5.83高級(jí)8027.25±4.82①

注：①和低分級(jí)癌組織相比P<0.05

表2 BTCC組織中組織蛋白酶B表達(dá)與復(fù)發(fā)的相關(guān)性

Table 2 The expression correlated of cathepsin B with recurrence in BTCC tissues

樣本n組織蛋白酶B陽(yáng)性細(xì)胞正常對(duì)照組160.34±0.18原發(fā)組7617.48±7.20第一次復(fù)發(fā)組4120.52±5.28第二次復(fù)發(fā)組3222.98±5.39第三次或以上復(fù)發(fā)組2325.124±4.53

注：每組間比較P<0.05

3 討論

Cathepsin B屬于半胱氨酸蛋白酶類。組織蛋白酶B通常以酶原的形式存在，需要激活后才能降解蛋白，組織蛋白酶B具有雙重蛋白水解活性使之能直接參與多種基底膜蛋白降解。生理情況下約10%酶原被分泌至胞漿，然后被其他蛋白水解酶水解或自身激活，參與許多生理過(guò)程，如激素原激活、抗原呈遞、組織器官發(fā)育等[1]。但病理狀態(tài)下，各種原因所致細(xì)胞損傷，如病原微生物、炎癥因子及氧化應(yīng)激等，導(dǎo)致溶酶體膜穩(wěn)定性降低，通透性增高甚至破裂，大量組織蛋白酶B釋放到胞漿或組織間隙，并被激活，介導(dǎo)細(xì)胞炎性壞死及凋亡的發(fā)生[2]，與關(guān)節(jié)炎、胰腺炎及其他急慢性炎癥性疾病有關(guān)。組織蛋白酶B還參與腫瘤血管的形成，新生血管形成是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移發(fā)展所必需的，其形成不僅使腫瘤生長(zhǎng)，而且由于新生血管基底膜的缺損從而提供了癌細(xì)胞進(jìn)人血管的途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的血行擴(kuò)散[3]。Sinha等用原位雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)人前列腺癌組織中，CBmRNA呈不均勻染色，且在腫瘤浸潤(rùn)邊緣染色最深，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)前列腺癌內(nèi)皮細(xì)胞中組織蛋白酶B表達(dá)增高，在正常及BPH中則不增加，這提示組織蛋白酶B可能參與前列腺癌組織中血管的生成[5，6]。以上這些現(xiàn)象和研究均說(shuō)明CB可以促進(jìn)腫瘤血管的形成，代表了腫瘤的轉(zhuǎn)移或轉(zhuǎn)移趨勢(shì)。

Weiss等應(yīng)用浸潤(rùn)性移行細(xì)胞癌細(xì)胞系EJ和非浸潤(rùn)性移行細(xì)胞癌細(xì)胞系RT4觀察了組織蛋白酶B在人類膀胱腫瘤浸潤(rùn)中的作用[7]。浸潤(rùn)性EJ細(xì)胞具有位于胞漿膜活性的組織蛋白酶B而非浸潤(rùn)性RT4細(xì)胞則限于溶酶體中，主要是其前體形式。EJ 細(xì)胞胞質(zhì)膜而不是RT4 細(xì)胞系的胞質(zhì)膜具有降解純化的層粘連蛋白的能力;認(rèn)為浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞在其胞質(zhì)膜中具有增強(qiáng)的組織蛋白酶B,可降解基底膜成分而利于腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。 Eijan等發(fā)現(xiàn)膀胱癌患者尿液中組織蛋白酶B的活性較高，并與腫瘤分期、分級(jí)相關(guān)[9，10]。應(yīng)用Wester blot分析膀胱移行細(xì)胞癌標(biāo)本，結(jié)果表明浸潤(rùn)型較淺表型CB表達(dá)高[9]。在骨肉瘤中也有類似發(fā)現(xiàn)，在肉瘤侵襲邊緣的組織蛋白酶B存在高表達(dá)現(xiàn)象，而在其相鄰的正常組織中則無(wú)表達(dá)最近的研究表明，膀胱腫瘤病人癌組織的細(xì)胞組織蛋白酶B、組織蛋白酶B高于對(duì)照組及癌旁組織[10，11]。同時(shí)還表明癌組織細(xì)胞不僅表達(dá)更多的組織蛋白酶而且更易釋放組織蛋白酶，在細(xì)胞膜降解、腫瘤侵襲方面扮演著積極的角色。

4 結(jié)論

組織蛋白酶B 陽(yáng)性表達(dá)在分級(jí)和分期高的癌組織中較低級(jí)、低期癌組織中增強(qiáng)，且在腫瘤組織的周邊部染色更明顯，出現(xiàn)組織蛋白酶B陽(yáng)性細(xì)胞聚集或基質(zhì)染色，表明伴隨惡性度的增高,組織蛋白酶B陽(yáng)性表達(dá)增高,提示其與膀胱癌惡性度的相關(guān)性。通過(guò)對(duì)每次復(fù)發(fā)的比較，發(fā)現(xiàn)隨著復(fù)發(fā)次數(shù)的增加組織蛋白酶B陽(yáng)性標(biāo)記指數(shù)在一定范圍內(nèi)增加，一旦出現(xiàn)分級(jí)突破其標(biāo)記指數(shù)會(huì)顯著增加，揭示了組織蛋白酶B在腫瘤復(fù)發(fā)與演進(jìn)中的表達(dá)意義。

【參考文 獻(xiàn)】

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Expression of cathepsin B in bladder transitional cell carcinoma tissues and its correlation with the recurrence of carcinoma

TANG Shuo1，WEI Qiang2,WANG Anguo1,etal

(1.DepartmentofUrology,TheSecondClinicalHospitalofNorthSichuanMedicalCollege,Nanchong637000,Sichuan,China;2.DepartmentofUrology，WestChinaHospital，SichuanUniversity，Chengdu610041，China)

Objective To evaluation the expression of cathepsin B in the transitional cell carcinorma of bladder (BTCC) and its correlation with the recurrence of carcinoma. Methods 172 tissues were collected from BTCC patients recurred for 3 times or more (3 times is contained) from 1994 to 2010. Immunohistochemical staining of CB in TCC and normal tissues was carried out by the streptavidin-biotin method. Results Immunohistochemistry stain demonstrated that the positive cells of cathepsin B was diffused in the cancer tissues with obvious stroma staining. The label index of BTCC tissues was obviously higher than that of normal tissues(P<0.01),and the label index is increased with the recurrence time(P<0.01). Conclusion The label index of high differentiation carcinoma is higher than that of low differentiation carcinoma. Cathepsin B staining of the normal bladder tissue is negative or only a few positive cells,but in the high grade and stage carcimoma tissues. The staining is positive and dispersed. Cathepsin B should be a good tool to determine the bladder tumor behavior and its prognosis.

Cathepsin B; Transitional cell carcinorma of bladder; Recurrence immunohistochemistry

南充市科技局資助項(xiàng)目(2010SF13)

李云祥，E-mail:liyunxiangwjsina.com

R 737.14

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.006

2014-10-10； 編輯： 張文秀)