朱駿 朱克祥 李汛 張峰, 袁得峰 周琪 金強

膽囊癌中Bim ID1和E2F1的表達及生物學(xué)意義

朱駿1朱克祥3李汛2張峰2,3袁得峰4周琪1金強1

(1.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū) 病理科， 甘肅 蘭州，730000；2.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院普外2科， 甘肅 蘭州，730000；

3.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū) 腫瘤內(nèi)科, 730000；4.蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū) 普外科，甘肅 蘭州 730000)

目的 探討B(tài)im、ID1和E2F1蛋白在膽囊癌組織中的表達及意義。方法 應(yīng)用組織芯片技術(shù)，免疫組織化學(xué)SP法對70例膽囊癌、20例高級別上皮內(nèi)瘤變、30例低級別上皮內(nèi)瘤變和20例膽囊炎癥組織進行Bim、ID1和E2F1蛋白檢測。結(jié)果 在膽囊癌、高級別上皮內(nèi)瘤變、低級別上皮內(nèi)瘤變和炎癥組織中，Bim陽性表達率分別為27.1%，30%，60%，65%，四組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ID1表達在四組中的陽性率分別為70%，65%，23.3%，20%，四組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。E2F1表達在四組中的陽性率分別為84.3%，75%，16.7%，10%，四組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。Bim與膽囊癌分化程度負相關(guān)(P<0.05)；與臨床Nevi分期無關(guān)(P>0.05)。ID1和E2F1與臨床Nevin分期相關(guān)(P<0.05)，與膽囊癌分化程度無關(guān)(P>0.05)。Bim分別與ID1、E2F1負相關(guān)(P<0.05)。生存分析Bim陽性患者生存率顯著高于ID1和E2F1陽性患者(P<0.05)。結(jié)論 Bim、ID1和E2F1與膽囊癌的發(fā)生相關(guān)；聯(lián)合檢測Bim、ID1和E2F1對膽囊癌早期診斷及判斷預(yù)后有重要的指導(dǎo)意義。

膽囊癌； Bim； ID1； E2F1

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，占全球膽道癌的80%～90%，占消化道惡性腫瘤的第5位[1]。多見于55～75歲。西北地區(qū)好發(fā)。在所有膽囊切除手術(shù)中膽囊腺癌占5%。眾多研究證實，細胞增殖失控在腫瘤的形成過程中發(fā)揮重要作用。而細胞增殖受多種因子調(diào)控，如凋亡調(diào)控因子Bim[2]，DNA結(jié)合抑制因子ID1[3]， 核轉(zhuǎn)錄因子E2F1[4]。本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測Bim、ID1和E2F1在膽囊癌、上皮內(nèi)瘤變以及炎癥組織中的表達，探討其在膽囊癌中的發(fā)生機制及生物學(xué)意義。

1 材料和方法

1.1 標本來源 收集蘭州大學(xué)第一醫(yī)院病理科及蘭州大學(xué)第一醫(yī)院東崗院區(qū)，自2000年～2013年12年間經(jīng)手術(shù)并病理檢查證實膽囊腺癌標本70例，按國際病理分級，高、中、低分化型分別為21例、27例和22例。另取20例高級別上皮內(nèi)瘤變、30例低級別上皮內(nèi)瘤變及20例膽囊炎癥標本作為對照。年齡37～78歲，中位年齡57歲。

1.2 構(gòu)建組織芯片及免疫組化染色 構(gòu)建組織芯片：組織芯片由蘭大一院東崗院區(qū)病理科制備。所有供體組織蠟塊行常規(guī)病理切片后做HE染色，病理專家作二次診斷，并在切片的典型病理區(qū)域做出標記，后再在相應(yīng)蠟塊上做出標記。用組織芯片制作儀在模具蠟塊上打出間距為 1 mm 直徑為 2mm 的孔。在標記好的組織蠟塊標記區(qū)域取材，用組織芯片制作儀鉆孔采集直徑 2 mm 的組織芯，將組織芯放到模具蠟塊相應(yīng)的孔內(nèi)。重復(fù)上述步驟制成陣列塊 5塊。以 4 μm 厚度進行連續(xù)切片，40℃ 裱片，56℃ 烤片 3 h后移至 37℃ 恒溫箱中過夜，常溫保存?zhèn)溆?。所得組織芯片的每個點都經(jīng)過病理診斷。同時制成組織芯片 H E切片，對所得組織芯片的每個點都重新進行形態(tài)觀察。缺失的點由對應(yīng)石蠟包埋組織切片補充。

二甲苯和梯度酒精各15min脫蠟，檸檬酸鹽緩沖液修復(fù)抗原，3%H2O2室溫封閉15min，羊血清(ZSGB-BIO)封閉15min，分別加Bim、ID1和E2F1一抗(Santa Cruz)，4℃過夜；室溫復(fù)溫30min，山羊抗兔二抗(ZSGB-BIO)溫室孵育15min，鏈霉卵白素(ZSGB-BIO)孵育15 min， DAB(ZSGB-BIO)顯色，自來水終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，分化返藍，脫水封片。

染色結(jié)果處理：以細胞質(zhì)中有棕黃色顆粒為陽性細胞。E2F1和ID1均以細胞質(zhì)或核膜染色為主，Bim以細胞質(zhì)為主。陽性判斷標準為該位置出現(xiàn)了棕黃色或棕褐色顆粒狀，并用陽性片作為對照，每張切片隨機選擇10個視野，40×10高倍顯微鏡下觀察計數(shù)方法。根據(jù)染色的濃度及陽性細胞的數(shù)量分別記分。不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。無陽性細胞染色為0分，陽性細胞數(shù)少于10%為1分，11～50%為2分，51%以上為3分。根據(jù)染色深度與陽性細胞數(shù)得分之和分為4級，即(-)為0分，弱陽性(+)為1～2分，陽性(++)為3～4分， 強陽性(+++)為5～6分[5]。染色深度與陽性細胞數(shù)得分之和大于3分為陽性表達。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用四格表的精確概率法，所有數(shù)據(jù)采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件分析應(yīng)用2檢驗，Bim和ID1、E2F1之間應(yīng)用Spearman相關(guān)分析，應(yīng)用Kaplan-Meier法生存分析，取顯著性檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 Bim、ID1和E2F1在膽囊病變組織中的表達特征 本研究利用免疫組化檢測Bim、ID1和E2F1在膽囊癌、高級別上皮內(nèi)瘤變、低級別上皮內(nèi)瘤變和炎癥組織中的表達。對其進行細胞定位，陽性信號呈現(xiàn)棕黃色。Bim表達于膽囊腺上皮及癌細胞的細胞質(zhì)，ID1和E2F1表達于膽囊腺上皮及癌細胞的細胞核或細胞質(zhì)，見圖1。

圖1 Bim、ID1和E2F1在膽囊癌、高級別上皮內(nèi)瘤變、低級別上皮內(nèi)瘤變和炎癥組織中的表達

Figure 1 The expression of Bim，ID1 and E2F1 in gallbladder cancer, high level intraepithelial neoplasia, low level intraepithelial neoplasia and inflammatory tissues

2.2 Bim、ID1和E2F1在膽囊病變組織中的表達 對Bim、ID1和E2F1在膽囊癌、高級別上皮內(nèi)瘤變、低級別上皮內(nèi)瘤變和炎癥組織中的表達進行統(tǒng)計，見表1。 Bim表達在4組中的陽性率分別為27.1%，30%，60%，65%，4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；膽囊癌與高級別上皮內(nèi)瘤變，高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變，低級別上皮內(nèi)瘤變與炎癥之間，相鄰兩組之間比較，高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。ID1表達在四組中的陽性率分別為70%，65%，23.3%，20%，4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相鄰兩組之間比較，高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。E2F1表達在四組中的陽性率分別為84.3%，75%，16.7%，10%，4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；相鄰兩組之間比較，高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

表1 Bim、ID1和E2F1在膽囊癌、上皮內(nèi)瘤變和增生組織中的表達

注:Bim、ID1和E2F1在膽囊病變組織中表達，4組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，①P<0.05；相鄰兩組比較，高級別上皮內(nèi)瘤變與低級別上皮內(nèi)瘤變之間，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，②P<0.05。

2.3 Bim、ID1和E2F1與膽囊癌臨床病理特征之間的關(guān)系 Bim、ID1和E2F1在膽囊癌組織中的表達與其分化程度和臨床Nevin分期的關(guān)系，結(jié)果如表2所示。Bim表達，Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期中陽性表達高于Ⅳ～Ⅴ期，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義P>0.05；高分化組陽性率顯著高于中、低分化組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。E2F1和ID1在Nevin分期Ⅰ～Ⅲ期組織中陽性率顯著高于Ⅳ～Ⅴ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義P<0.05；E2F1和ID1表達，高分化組陽性率高于中、低分化組，但差異具無統(tǒng)計學(xué)意義，P>0.05。

表2 膽囊癌中Bim、ID1和E2F1與臨床病理聯(lián)系

注：①Bim表達，膽囊癌高分化與中-低分化兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。ID1、E2F1表達，膽囊癌臨床分期Ⅰ～Ⅲ期，Ⅳ～Ⅴ期兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05。

2.4 膽囊癌中Bim、ID1和E2F1的相關(guān)性 膽囊癌組織中，Bim與E2F1負相關(guān)(r=-0.531，P<0.05)，Bim與ID1負相關(guān)((r=-0.301，P<0.05)，見表3。

表3 膽囊癌中Bim、ID1和E2F1的相關(guān)性

注：①Bim分別與ID1和E2F1比較，負相關(guān)，P<0.05

2.5 Bim、ID1和E2F1與膽囊癌患者生存率之間的關(guān)系 膽囊癌患者Bim陽性表達生存率高于ID1和E2F1表達，差異有統(tǒng)計學(xué)意義，P<0.05，見圖2。

3 討論

膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，近年來發(fā)病呈上升趨勢，且起病隱匿，惡性程度高，預(yù)后極差[6-8]。細胞凋亡與增殖在腫瘤發(fā)生及發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用。

圖2 膽囊腺癌Bim、ID1和E2F1陽性患者Kapan-Meier生存曲線

Figure 2 Expression of Bim,ID1和E2F1 in Gallbladder carcinoma patients texted to be translated Kapan - Meier survival curve

Bim基因?qū)儆贐cl-2家族，含有BH3結(jié)構(gòu)域，后者是細胞凋亡起始的必需因子[7]。 Bim在多種正常細胞中均有表達，通過PI3K/PKB途徑導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a活化，上調(diào)Bim的表達引起癌細胞凋亡[10]。 Bim在乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌中低表達或表達缺失[11]，本組實驗， Bim在膽囊癌、高級別上皮內(nèi)瘤變、低級別上皮內(nèi)瘤變、炎癥組織中表達逐漸上調(diào)，提示Bim在膽囊病變中通過上調(diào)細胞凋亡抑制腫瘤。

分化抑制因子ID1是ID蛋白家族中的一種亞型，是螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子家族的成員之一。已有報道證實ID1已有報道證實ID1可以通過參與細胞周期素D對c-myc蛋白表達的依賴性途徑，促進細胞增殖[12]，且是淋巴結(jié)陰性乳腺癌患者的獨立預(yù)后因子[13]，Gupta等人發(fā)現(xiàn)在人類三陰( ER、P R、HER2均陰性)乳腺癌亞型中ID1是肺轉(zhuǎn)移的調(diào)節(jié)者[14]。本研究發(fā)現(xiàn)ID1在膽囊癌的表達顯著高于上皮內(nèi)瘤變及炎癥組織，提示其與膽囊腺癌的發(fā)生相關(guān)。

E2F1作為E2Fs轉(zhuǎn)錄因子家族的一員，調(diào)控DNA復(fù)制及細胞周期進程相關(guān)基因的表達[15]，過表達的E2F1促進細胞從G0/G1期進入S期，促進細胞增殖及惡性轉(zhuǎn)化。國內(nèi)外研究表明，E2F1在胃癌、乳腺浸潤性導(dǎo)管、膀胱癌、淋巴瘤等多種惡性腫瘤中過表達[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)E2F1在膽囊腺癌的表達顯著高于上皮內(nèi)瘤變及炎癥組織，提示E2F1與膽囊腺癌的發(fā)生相關(guān)。本研究結(jié)果顯示E2F1和ID1均與臨床分期顯著相關(guān)，提示E2F1和ID1過表達與膽囊腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)，對臨床分期有重要指導(dǎo)意義。

本研究發(fā)現(xiàn)膽囊腺癌組織中，Bim分別與比較，負相關(guān)P<0.05，提示聯(lián)合Bim、ID1和E2F1檢測有助于膽囊癌的早期診斷。 生存分析提示Bim表達的患者生存率高于ID1和E2F1，提示聯(lián)合檢測Bim、ID1和E2F1有助于判斷膽囊癌預(yù)后。

推測促凋亡因子Bim和ID1、E2F1之間存在拮抗關(guān)系；Bim通過促進細胞凋亡從而抑制癌癥的發(fā)生發(fā)展，E2F1、ID1促進細胞增殖促進腫瘤組織的發(fā)生發(fā)展，三者之間存在某種制衡。

4 結(jié)論

Bim在膽囊癌中低表達，對膽囊癌癌細胞凋亡的調(diào)控能力減弱，導(dǎo)致腫瘤細胞克隆、增殖。ID1在膽囊癌中的表達顯著高于上皮內(nèi)瘤變及炎癥組織，其過量表達促進膽囊癌細胞無限增殖。E2F1過表達與膽囊上皮細胞惡變及增殖相關(guān)，促進膽囊腺癌的發(fā)生。同時本研究顯示E2F1和ID1過表達與膽囊腺癌浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)?？梢娐?lián)合檢測Bim、ID1和E2F1對膽囊癌早期診斷及判斷預(yù)后具有重要的指導(dǎo)意義[18]。

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Expression and biological significance of Bim,ID1 and E2F1 in gallbladder cancer tissue

ZHU Jun1, ZHU Kexiang2, LI Xun2，3,etal

(1.DepartmentofPathology,DonggangSection,TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China;2.DepartmentofSurgery2,TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China;3.DepartmentofTumor,DonggangSection,TheFirstHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou730000,China)

Objective To investigate the expression and significance of Bim,ID1and E2F1 in gallbladder cancer tissue. Methods The application of tissue microarray technology and immunohistochemical method was used in 70 cases of the gallbladder cancer (group A), 20 cases of high level intraepithelial neoplasia (group B), 30 cases of low level intraepithelial neoplasia (group C) and 20 cases of cholecystitis tissues (group D). Results The positive expression rate of Bim in group A, B, C and D were 27.1%, 30%, 60% and 65% (P<0.05). The positive expression rate of ID1 in group A, B, C and D were 70%, 65%, 23.3% and 20% (P<0.05). The positive expression rate of E2F1 group A, B, C and D were 84.3%, 75%, 16.7% and 10% (P<0.05). Bim was negatively related to the gallbladder cancer differentiation degree (P<0.05), but not correlated with clinical Nevin stage (P>0.05). ID1 and E2F1were significantly correlated with clinical Nevin stage (P<0.05), but not correlated with the gallbladder cancer differentiation degree (P>0.05). Survival analysis show that the lifetime of Bim positive patient was significantly higher than that of ID1and E2F1 positive patients (P<0.05).Conclusion Bim, ID1 and E2F1 may play an important role in the generation and development of the gallbladder cancer. The joint detection of Bim, ID1 and E2F1 protein has some degree of guiding significance in early diagnosis and prognosis of the gallbladder cancer.

Gallbladder cancer; Bim; ID1; E2F1

國家自然科學(xué)基金(31270543)

李汛：教授，本刊副主編，E-mail：lxdr21@souhu.com

R 735.8

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.02.004

2015-06-18； 編輯： 張文秀)