任訊 彭敏 廖娟 田鯤

妊娠期齦炎中牙齦卟啉單胞菌的表達水平*

任訊 彭敏 廖娟 田鯤

(四川省醫(yī)學科學院·四川省人民醫(yī)院口腔科， 四川 成都 610072)

目的 探討牙齦卟啉單胞菌在不同孕期的妊娠期齦炎中的作用，為妊娠期齦炎的防治提供相關依據(jù)。方法 依照世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的口腔健康基本調查方法，對240例妊娠期齦炎婦女進行口腔檢查，評估并記錄相應的牙齦健康指標(GI、SBI)和牙體健康指標(DMFT、DMFS)；采集齦溝液標本，用PCR技術檢測牙齦卟啉單胞菌的表達水平。結果 早孕/中孕/晚孕3組中，晚孕組的牙齦指標(GI=1.28±0.35，SBI=0.89±0.37)最高(P<0.05)，患齲指標(DMFT=1.85±0.98，DMFS=2.90±1.82)最高(P<0.05)，牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量最多(P.gCT=0.0521±0.0017,P<0.05)。早孕/中孕/晚孕3組中，牙齦指標GI，SBI與牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量均呈正相關(均P<0.05)。結論 懷孕的時間越長，妊娠期齦炎的癥狀越嚴重，牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量也越多，推測牙齦卟啉單胞菌在妊娠期齦炎的發(fā)展中扮演著重要的角色。

妊娠期齦炎； 牙齦卟啉單胞菌； 齦炎指數(shù)； 齦溝出血指數(shù)； 聚合酶鏈式反應

妊娠期齦炎(pregnancy gingivitis)是婦女在妊娠期間易患的一種口腔疾病，其患病率報道不一，估計在30%～100%之間[1,2]。妊娠期齦炎不僅會危害孕婦的身心健康，還會嚴重影響胎兒的生長發(fā)育[3，5]。微生物感染是妊娠期齦炎的直接致病因子，牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)作為牙周牙齦炎的主要致病菌，在齦下菌斑中的檢出率較高，對牙周組織造成危害[6]。多項研究[7～10]發(fā)現(xiàn)，妊娠期齦炎的患病率隨著孕期的增長而上升，且在不同孕期齦下菌斑的細菌檢出水平存在明顯差異[11]。本研究依照世界衛(wèi)生組織(WHO)制定的口腔健康基本調查方法對妊娠期齦炎患者進行口腔臨床檢查，并用聚合酶鏈式反應技術(polymerase chain reaction, PCR)檢測牙齦卟啉單胞菌的表達水平，以探討牙齦卟啉單胞菌在不同孕期的妊娠期齦炎中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對象 為2013年1月～2015年6月在四川省人民醫(yī)院體檢的240例妊娠期齦炎婦女被納入本實驗。納入標準：無全身系統(tǒng)性疾病，在3個月內無牙周病治療史，無抗菌藥物和非甾體類抗炎藥物服用史；口腔內天然牙在20顆以上；牙齦鮮紅色，水腫肥大，且有明顯探診出血傾向。所有受試者均簽署知情同意書。240例受試者按照懷孕時間的長短分為早孕組(1～3個月)100例、中孕組(4～6個月)64例和晚孕組( 7～9個月)76例。

1.2 檢查指標 參考WHO推薦的口腔健康調查基本方法，由兩名醫(yī)生分別檢查受試者的口腔衛(wèi)生狀況并記錄以下牙體牙齦健康評估指數(shù)：齦炎指數(shù)(gingivitis index, GI)、齦溝出血指數(shù)(sulcus bleeding index, SBI)、齲均(decayed, missing and filled tooth, DMFT)，齲面均(decayed, missing and filled surfaces, DMFS)。Kappa值為0.8，一致性良好。

1.3 牙齦卟啉單胞菌樣本的采集和檢測

1.3.1 樣本采集 將研究對象口腔分為4個區(qū)，每個區(qū)牙周探診最深位點作為取樣位點。用無菌刮匙去除取樣牙的齦上菌斑，在隔濕、干燥的狀況下，將2mm×8mm的濾紙條放入齦溝內，60s后取出，放入含裂解液的EP管中，于-20℃凍存。

1.3.2 引物設計 參照Genebank中16s rDNA的基因序列AF285870，合成檢測牙齦卟啉單胞菌16srDNA基因引物，擴增510bp片段(nt. 91～601)。引物序列：上游5′-GCG TAT GCA ACT TGC CTT AC-3′，下游5′-GTT TCA ACG GCA GGC TAAC-3′。

1.3.3 DNA提取 樣本在室溫下解凍30min，充分震蕩混勻，移取部分至另一只EP管中。將質量分數(shù)25%的Chelex-100與樣本按體積比1∶3的比例混合，震蕩混勻，56℃ 加熱30min，使Chelex-100與樣本溶液中的金屬陽離子螯合。100℃加熱10min，使細菌細胞徹底裂解，細菌DNA充分釋放入溶液，再于4℃下15000 r/min離心8min，使與金屬陽離子螯合的Chelex-100沉淀下來，最后收集含有DNA的上清液于-20℃凍存。

1.3.4 16s rRNA熒光定量PCR測定 將上述上清液20μl加入到100μl去離子水中，100℃水浴10min，取4μl上清液作為PCR模板。以ATCC 33277牙齦卟啉單胞菌作為PCR檢測的陽性對照，等體積的蒸餾水作為空白對照。所有試驗樣本檢測均按照盲法要求進行，最后隨機抽取10%的樣本做重復性檢驗。

1.4 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，不同孕期臨床指標、牙齦卟啉單胞菌表達量的比較采用ANOVA方差分析，臨床指標與牙齦卟啉單胞菌表達量之間的關聯(lián)采用Pearson相關性分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 不同孕期牙齦健康狀況比較 結果顯示，GI和SBI均表現(xiàn)出隨懷孕時間的增長而增高的趨勢，晚孕組的GI/SBI最高，早孕組的最低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示懷孕時間越長，受試者的牙齦健康狀況越差，妊娠期齦炎越嚴重，見表1。

Table 1 Comparison of gingival health status at different stages of pregnancy

臨床指標早孕(n=100)中孕(n=64)晚孕(n=76)FPGI0.33±0.160.73±0.421.28±0.354.9920.041SBI0.27±0.090.45±0.110.89±0.376.2160.010

2.2 不同孕期牙體健康狀況比較 結果顯示，DMFT和DMFS均表現(xiàn)出隨懷孕時間的增長而增高的趨勢，晚孕組的DMFT/DMFS最高，早孕組的最低，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，提示懷孕時間越長，受試者的牙體健康狀況越差，患齲的情況越嚴重，見表2。

表2 不同孕期牙體健康狀況比較±s)

2.3 不同孕期牙齦卟啉單胞菌表達量比較 結果顯示，懷孕的時間越長，牙齦卟啉單胞菌基因的CT值越大，即牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量越多，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表3 不同孕期牙齦卟啉單胞菌基因CT值比較±s)

2.4 牙齦健康狀況與牙齦卟啉單胞菌表達量的相關性 在早孕、中孕和晚孕組中，GI/SBI與牙齦卟啉單胞菌表達量均呈顯著的正相關性(均P<0.05)，說明受試者的牙齦炎癥越嚴重，齦溝內的牙齦卟啉單胞菌數(shù)量越多，見表4。

2.5 牙體健康狀況與牙齦卟啉單胞菌表達量的相關性 在早孕、中孕和晚孕組中，DMFT/DMFS與牙齦卟啉單胞菌的表達量均無相關性(均P>0.05)，提示齦溝內的牙齦卟啉單胞菌數(shù)量與牙齒患齲的情況并無明顯關聯(lián)，見表5。

表4 GI/SBI與牙齦卟啉單胞菌表達量的Pearson相關性

表5 DMFT/DMFS與牙齦卟啉單胞菌表達量的Pearson相關性

3 討論

近年來，隨著生活水平的提高，雖然大眾的口腔衛(wèi)生保健意識比過去有了很大的提升，妊娠期齦炎的發(fā)病率卻居高不下，成為了危害孕婦口腔健康的常見多發(fā)病[12]。妊娠期齦炎的病因機制較為復雜，和妊娠期女性體內激素水平的增高，牙齒表面沉積牙結石和菌斑的刺激以及免疫應答水平的改變均有關聯(lián)。齦黏膜內雌激素和孕酮水平增高，引起牙齦組織內血液循環(huán)和新陳代謝的改變，牙齦毛細血管通透性增高，炎癥細胞滲出增多，炎癥因子如前列腺素E2等的合成增多，上皮角化和細胞再生能力下降，上皮屏障功能降低，使得牙齦組織對局部刺激的敏感度增高，可使原有的牙齦炎癥狀加重[13]。

妊娠期齦炎一直是口腔牙周學者重點關注的問題，多項針對中國人群的研究[7～10]發(fā)現(xiàn)，懷孕周期越長，妊娠期齦炎患病率越高，牙齦炎臨床癥狀越嚴重?？赡苁且驗樵袐D行動不便造成刷牙次數(shù)不夠或者刷牙不徹底導致口腔衛(wèi)生狀況惡化，隨著懷孕周期越來越長，牙齒表面的菌斑和牙結石越積越多，牙周組織的局部刺激因子大量堆積，齦炎癥狀愈發(fā)嚴重。再加上部分孕婦的口腔健康保健意識較弱，出現(xiàn)牙齦出血等牙齦炎癥狀時未能及時就診，使得牙齦炎癥狀持續(xù)加重[14]。本文的結果亦證實了這一點，隨著懷孕時間的增長，GI和SBI均不斷增高，晚孕組的GI和SBI最高。此外，隨著孕期的增長，孕婦的患齲情況也越來越嚴重，DMFT和DMFS都在不斷地增高。

牙齦卟啉單胞菌是目前國際上公認的牙周可疑致病菌，在牙周病發(fā)病的早期和活動期，牙齦卟啉單胞菌數(shù)量增加是重要的特征。牙齦卟啉單胞菌依靠其表面的纖毛、莢膜、外膜和膜泡等結構黏附于宿主細胞，產(chǎn)生胞外蛋白酶，破壞牙周組織結構，還可抑制宿主對細菌的先天性免疫機制[15]。牙齦卟啉單胞菌的檢測需要盡可能做到靈敏、準確和迅速。牙齦卟啉單胞菌為專性厭氧菌，在唾液中存在的數(shù)量較少，傳統(tǒng)的細菌培養(yǎng)法不易檢測成功，而16s rRNA PCR技術兼?zhèn)潇`敏、準確和迅速的特點，能夠準確鑒定出唾液、齦溝液中的牙齦卟啉單胞菌[16～18]。因此本研究采用16S rRNA PCR技術來檢測牙齦卟啉單胞菌的表達量。結果發(fā)現(xiàn)懷孕的時間越長，牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量越多，且牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量與牙齦健康指標GI/SBI均呈正相關，為牙齦卟啉單胞菌在妊娠期齦炎中扮演的角色提供了依據(jù)。然而牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量與牙體健康指標DMFT/DMFS之間并無顯著的關聯(lián)，這可能是因為牙齦卟啉單胞菌為牙周主要致病菌，主要影響牙齦和牙周組織的健康，對齲齒等牙體硬組織疾病的作用很小。

4 結論

牙齦卟啉單胞菌在妊娠期齦炎的發(fā)展中扮演著重要的角色，懷孕的時間越長，牙齦炎癥越嚴重，牙齦卟啉單胞菌的數(shù)量也越多。因此，口腔健康檢查應列為孕前孕期常規(guī)檢查項目。妊娠期婦女應當加強口腔衛(wèi)生保健意識，積極地進行口腔衛(wèi)生的日常護理和口腔疾病的治療[19～21]。

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Expression level of porphyromonas gingivalis in pregnancy gingivitis

REN Xun,PENG Ming,LIAO Juan,etal

(DepartmentofStomatology,SichuanInstituteofMedicalScienceAcademy·SichuanPeopleHospital,Chengdu610072,China)

Objective To investigate the role of porphyromonas gingivalis (P.g) in pregnancy gingivitis among various pregnancy stages and provide evidence for the prevention of pregnancy gingivitis. Methods According to the World Health Organization oral health survey basic method, 240 pregnancy gingivitis women were selected for oral examination and their gingival crevicular fluid was collected for P.g detection via PCR method. Results Among three stages, the highest GI (1.28±0.35), SBI (0.89±0.37), DMFT (1.85±0.98), DMFS (2.90±1.82) and amount of P.g were detected in late stage of pregnancy (P<0.05). GI or SBI was positively correlated to the amount ofP.g(P<0.05). Conclusion Longer pregnancy period would result in severer gingival inflammation and higher P.g amount. It is suggested that P.g plays an essential role in the development of pregnancy gingivitis.

Pregnancy gingivitis; Porphyromonas gingivalis; Gingivitis index; Sulcus bleeding index; Polymerase chain reaction

四川省衛(wèi)生廳科研課題(2014SZ0018)

彭敏，E-mail:oivy@163.com

R 714.14; R 781.4+1

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.027

2015-12-02； 編輯： 母存培)