韋舒杰 何科成 楊永健 張彥 王強 李德 楊大春

貴州小型豬血壓及靶器官損害評價*

韋舒杰 何科成 楊永健 張彥 王強 李德 楊大春

(成都軍區(qū)總醫(yī)院心血管內(nèi)科， 四川 成都 610083)

目的 發(fā)現(xiàn)并評價一種新的高血壓小型豬模型，并對其相關(guān)靶器官損害情況進行分析。方法 監(jiān)測6、12、18個月齡貴州小型豬(n=5)動脈血壓水平，并將其與同月齡家豬(n=5)作對比，測量18月齡時兩組隨機血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、肌酐(Scr)、尿素氮水平(BUN)，ELISA法測量其血清腎上腺素(Epinephrine,E)、去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)及 尿香草扁桃酸(Vanilmandelic acid,VMA)水平，放射免疫法測定腎素(Renin)活性、血管緊張素Ⅰ(AngiotensineⅠ)、血管緊張素Ⅱ(AngiotensineⅡ)、醛固酮(Aldosterone)水平，左心室游離壁及腎皮質(zhì)取材并進行H&E、MASSON染色。結(jié)果 與6、12、18同月齡家豬比較，貴州小型豬動脈收縮壓及舒張壓明顯升高(P<0.01)；18個月齡時貴州小型豬血清TC[(3.11±0.09)mmol/L、TG[(0.62±0.04)mmol/L]、LDL[(1.81±0.05)mmol/L]水平顯著高于家豬(均P<0.05)，而GLU、HbA1c、Scr及BUN水平則無明顯差異(均P>0.05)；貴州小型豬血清E、NE、DA及尿VMA水平分別為[(6968.68±426.10)pg/ml]、[(20.21±0.91)ng/ml]、[(27404.26±4257.96)pg/ml]和[(61.36±2.14)ng/ml]均顯著高于家豬(均P<0.01)，而腎素、血管緊張素Ⅰ、血管緊張素Ⅱ、醛固酮水平則無明顯差異(均P>0.05)；對其靶器官心臟及腎臟HE及Masson染色結(jié)果顯示，貴州小型豬相對于家豬，左心室游離壁有明顯心肌細胞肥大及少量心肌纖維化，心肌細胞橫截面面積[(651.05±7.58) μm2]顯著高于家豬(P<0.01)，且腎小球有萎縮及輕微纖維化表現(xiàn)。結(jié)論 近交系貴州小型豬可成為一種新的動脈高血壓動物模型，其交感系統(tǒng)活性活躍，且心臟及腎臟均可形成類似高血壓靶器官損害的特征。

小型豬；高血壓；高血壓靶器官損害

原發(fā)性高血壓(essential hypertension)是心血管疾病的主要危險因素之一，無論是在發(fā)達地區(qū)還是發(fā)展中國家都是重要的公共衛(wèi)生問題，而且它是一種復(fù)雜的多因素疾病，受到遺傳和環(huán)境多重因素的影響[1, 2]?，F(xiàn)階段，已有多種實驗性高血壓動物模型被建立模擬人類高血壓反應(yīng)，最為人熟知的則是自發(fā)性高血壓大鼠動物模型[3]。

自自發(fā)性高血壓大鼠選育成功以來，因其發(fā)病機制、高血壓心血管并發(fā)癥等與人類相似，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于高血壓病的醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)試驗研究[4,5]。另也有不少建立小鼠或大鼠繼發(fā)性實驗性高血壓模型用于高血壓的機制研究[6,7]。然而以上均是以小型動物作為試驗承載體，故缺乏能更好地模擬人類原發(fā)性高血壓的大型動物模型，且在試驗新型藥物、醫(yī)用設(shè)備裝置以及臨床前研究等方面的價值都略顯不足。另一方面，實驗狗和猴會更多面臨動物保護、價格昂貴等問題，而小型豬作為大型動物有著同人類相似的解剖結(jié)構(gòu)和生理特征等許多獨特優(yōu)勢，多用于轉(zhuǎn)化研究、手術(shù)模型、臨床前毒物試驗等[8]。本研究旨在發(fā)現(xiàn)提供一種新的小型豬高血壓模型，與普通家豬作為對比，檢測其生理特征，并對其高血壓相關(guān)靶器官損害情況進行分析評價。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及血壓測量 貴州小型豬及家豬各5只，于1.5月齡時由成都達碩實驗動物有限公司提供，雌雄不限。動物實驗經(jīng)過成都軍區(qū)總醫(yī)院動物管理委員會批準。于意識清醒、靜息狀態(tài)下測量家豬及貴州小型豬(n=5)在6、12、18月齡時的尾動脈血壓(BP-98E，北京軟隆生物技術(shù)有限公司)，每只測量有效數(shù)據(jù)3次，取收縮壓及舒張壓的平均值。

1.2 檢測指標 兩組模型豬均于18月齡時前腔靜脈穿刺取血，采用全自動生化分析儀(AU2700，日本奧林巴斯)測量其血清隨機血糖(GLU)、糖化血紅蛋白(HbA1c)、總膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL)、肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)水平。放射免疫法測定腎素(Renin)活性、血管緊張素Ⅰ(ANGⅠ)、血管緊張素Ⅱ(ANGⅡ)、醛固酮(Aldosterone)水平。

1.3 血清及尿樣ELISA分析 前腔靜脈穿刺采集的血樣及膀胱穿刺采集的尿樣經(jīng)離心分離出血清和尿標本，ELISA法(Elabscience，中國武漢)分別測量血清腎上腺素 (E)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)及尿香草扁桃酸(VMA)水平。

1.4 病理染色 18月齡處死兩組模型豬，對左心室游離壁及腎皮質(zhì)取材，固定脫水后石蠟切片，并進行H&E以及MASSON染色。測量心肌細胞橫截面面積：心肌組織H&E染色中，光鏡下觀察于心肌橫斷面選取細胞核位于中央的心肌細胞,細胞橫徑為經(jīng)細胞核至細胞短軸邊緣，細胞縱徑為經(jīng)細胞核至細胞長軸邊緣，每張切片隨機選取5個視野(×100)，每次計數(shù)40個細胞，通過Image-Pro Plus軟件定標后測量細胞橫截面面積，取平均值用于分析。

2 結(jié)果

2.1 兩組間動脈血壓比較 6、12、18月齡時貴州小型豬收縮壓分別為[(161.00±1.98)mmHg]、[(174.80±6.74)mmHg]、[(178.80±2.67)mmHg]，舒張壓分別為[(111.40±7.10)mmHg]、[(110.80±5.54)mmHg]、[(116.60±6.99 )mmHg]；同月齡家豬收縮壓分別為[(133.20±8.94)mmHg]、[(133.80±4.5) mmHg]、[(141.20±2.63)mmHg]，舒張壓分別為[(72.80±3.61)mmHg]、[(81.80±3.54)mmHg]、[(90.00±2.57)mmHg]，貴州小型豬收縮壓及舒張壓均顯著高于同月齡家豬，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)，見圖1。

圖1 家豬與貴州小型豬動脈血壓比較

Figure 1 The comparison of arterial pressure between the domestic pigs and Guizhou mini-pigs

注：A為動脈收縮壓，B為動脈舒張壓

2.2 兩組間生理指標比較 18月齡時貴州小型豬血清TC、TG、LDL水平顯著高于家豬，組間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)；而GLU、HbA1c、Scr及BUN水平則無明顯差異(均P>0.05)，見表1。

2.3 ELISA法及放射免疫法檢測結(jié)果比較 18月齡時貴州小型豬血清E、NE、DA及尿VMA水平與同月齡家豬比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，提示貴州小型豬交感系統(tǒng)激素水平顯著高于家豬；而RAAS系統(tǒng)Renin活性、ANGⅠ、ANGⅡ、醛固酮水平則無明顯差異(均P>0.05)，見表2。

Tab 1 The comparison of blood parameters between Guizhou mini-pigs and domestic pigs

參數(shù)家豬貴州小型豬GLU(mmol/L)4.07±0.244.59±0.14HbA1c(×10-2)4.38±0.194.98±0.10TC(mmol/L)2.53±0.103.11±0.09①TG(mmol/L)0.24±0.030.62±0.04①LDL(mmol/L)1.24±0.051.81±0.05①HDL(mmol/L)0.84±0.030.90±0.02Scr(μmol/L)59.22±3.1158.98±1.50BUN(mmol/L)3.28±0.463.73±0.28

注：與家豬相比，①P<0.05

Tab 2 The comparison of related hormone levels between Guizhou mini-pigs and domestic pigs

參數(shù) 家豬貴州小型豬E(pg/ml)910.10±46.176968.68±426.10①NE(ng/ml)3.23±0.1320.21±0.91①DA(pg/ml)842.77±27.7827404.26±4257.96①Renin(pg/ml)2380.38±147.752502.00±525.81ANGⅠ(pg/ml)3015.44±917.743592.49±968.65ANGⅡ(pg/ml)78.07±20.5866.08±14.12Aldosterone(pg/ml)131.71±8.44122.56±19.49VMA(ng/ml)31.75±0.7761.36±2.14①

注：與家豬相比，①P<0.01

2.4 靶器官組織學(xué)分析 左心室游離壁H&E和MASSON染色結(jié)果顯示，18月齡時貴州小型豬相比家豬，心肌細胞橫截面面積[(651.05±9.08)μm2]顯著高于家豬[(453.50±7.58)μm2]，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，且有顯著的心肌細胞肥大及少量的心肌纖維化；腎皮質(zhì)H&E和MASSON染色結(jié)果顯示，貴州小型豬出現(xiàn)輕微的腎小球萎縮及微量的纖維化，見圖2、3。

圖2 貴州小型豬與家豬心肌細胞橫截面面積對比

Figure 2 The comparison of cardiomyocyte area between Guizhou mini-pigs and domestic pigs

注：與家豬相比，①P<0.01

3 討論

高血壓是一種多因子疾病，涉及到遺傳和環(huán)境因素之間復(fù)雜的相互作用，而科學(xué)研究允許我們利用多種多樣的技術(shù)方法剝離出一個或數(shù)個因素來創(chuàng)造高血壓的動物模型供于高血壓的機制研究[9]，比如轉(zhuǎn)基因高血壓動物[10, 11]、內(nèi)分泌高血壓動物[7, 12]、環(huán)境干擾型高血壓動物[13, 14]等等，其中自發(fā)性高血壓大鼠是唯一能模擬人類原發(fā)性高血壓的動物模型[4]，然而轉(zhuǎn)化研究通常以豬這一類的大動物為研究模型。豬一直以來以其解剖及生理上與人類心血管系統(tǒng)的類似，得到眾多研究者的青睞，相比小動物有著得天獨厚的優(yōu)勢，其中特別是小型豬,因其高度可用性而受到轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)越來越多的選擇。盡管當(dāng)前的研究中不缺乏利用豬作為動物模型創(chuàng)造繼發(fā)性高血壓的資料[15, 16]，但本研究是首次報道描述動脈高血壓小型豬模型。貴州小型豬建系于中國貴州，現(xiàn)已廣泛用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的研究，我們選擇與正常家豬進行比較，發(fā)現(xiàn)在6個月齡時貴州小型豬動脈血壓升高，明顯高于同月齡家豬，且隨著月齡的增加，收縮壓及舒張壓呈現(xiàn)上升的趨勢。對高血壓相關(guān)靶器官損害情況進行分析，我們發(fā)現(xiàn)貴州小型豬心肌細胞肥大、心肌纖維化，腎小球有萎縮及纖維化的跡象，證實其動脈血壓高值確實存在，且進一步造成了類似于人類高血壓的并發(fā)癥。進一步追查其誘發(fā)高血壓的原因，對其生理指標和主要影響動脈血壓的交感神經(jīng)系統(tǒng)和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)進行檢測后，發(fā)現(xiàn)其血脂的異常以及交感系統(tǒng)活性的亢進，這些證據(jù)都提示交感神經(jīng)系統(tǒng)過度活躍參與并維持貴州小型豬的自發(fā)性高血壓。貴州小型豬乃是由貴州香豬引進后經(jīng)歷實驗動物化的開發(fā)和培育形成的小型豬品系，我們有理由推測其近交系的發(fā)展可能受到表觀遺傳學(xué)方面的影響，但遺憾的是，本研究暫時缺乏表觀遺傳學(xué)的進一步探尋。

圖3 兩組靶器官H&E和MASSON染色

Figure 3 The target organs of two groups were stained with H&E and Masson trichrome

注:A、B為心肌組織H&E染色，C、D為腎皮質(zhì)H&E染色，E、F為心肌組織MASSON染色，G、H為腎皮質(zhì)MASSON染色，箭頭所指藍色處為纖維素沉積區(qū)域

4 結(jié)論

本研究通過測量不同月齡近交系貴州小型豬動脈血壓、測定交感神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)激素水平以及對高血壓靶器官的組織學(xué)分析，證實了貴州小型豬動脈高血壓的存在和靶器官的損害，進一步提供了一種可能歸因于交感系統(tǒng)亢進創(chuàng)新的高血壓小型豬模型，為今后可用于轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)探討原發(fā)性高血壓機制提供了更優(yōu)秀的動物選擇。

[1]Yadav S, Boddula R, Genitta G,etal. Prevalence & risk factors of pre-hypertension & hypertension in an affluent north Indian population[J]. Indian J Med Res, 2008, 128(6): 712-720.

[2]Danaei G,Ding EL, Mozaffariarn D,etal. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors[J]. PLoS Med, 2009, 6(4): e1000058.

[3]Leong XF, CY Ng, Jaarin K. Animal Models in Cardiovascular Research: Hypertension and Atherosclerosis[J]. Biomed Res Int, 2015, 2015: 528757.

[4]Okamoto K, Aoki K. Development of a strain of spontaneously hypertensive rats[J]. Jpn Circ J, 1963, 27: 282-293.

[5]Welch WJ, Baumgaltl H, Lubbers D,etal. Renal oxygenation defects in the spontaneously hypertensive rat: role of AT1 receptors[J]. Kidney Int, 2003,63(1): p. 202-208.

[6]Mullins JJ, Peters J, Ganten D. Fulminant hypertension in transgenic rats harbouring the mouse Ren-2 gene[J]. Nature, 1990,344(6266): 541-544.

[7]Iyer A, Chan V, Brown L. The DOCA-Salt Hypertensive Rat as a Model of Cardiovascular Oxidative and Inflammatory Stress[J]. Curr Cardiol Rev, 2010, 6(4): 291-297.

[8]Swindle MM, Malcin A, Herron AJ,etal. Swine as models in biomedical research and toxicology testing[J]. Vet Pathol, 2012, 49(2): 344-356.

[9]Lerman LO,Chade AR,Sicav,etal. Animal models of hypertension: an overview[J]. J Lab Clin Med, 2005, 146(3): 160-173.

[10] Kintsurashvili E,Shenouda S,Ona D,etal. Hypertension in transgenic mice with brain-selective overexpression of the alpha(2B)-adrenoceptor[J]. Am J Hypertens, 2009, 22(1): 41-45.

[11] Tornavaca O,Pascual G,Barreiro ML,etal. Kidney androgen-regulated protein transgenic mice show hypertension and renal alterations mediated by oxidative stress[J]. Circulation, 2009, 119(14): 1908-1917.

[12] Chamorro V,Wangensteen R,Sainz J,etal. Protective effects of the angiotensin II type 1 (AT1) receptor blockade in low-renin deoxycorticosterone acetate (DOCA)-treated spontaneously hypertensive rats[J]. Clin Sci (Lond), 2004, 106(3): 251-259.

[13] Bechtold AG,Patel G,Hochhaus G,etal. Chronic blockade of hindbrain glucocorticoid receptors reduces blood pressure responses to novel stress and attenuates adaptation to repeated stress[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2009, 296(5): R1445-1454.

[14] Smith PA,Graham LN,Mackintosh AF,etal. Sympathetic neural mechanisms in white-coat hypertension. J Am Coll Cardiol, 2002, 40(1): 126-132.

[15] Lerman LO,Schwartz RS,Grande JP,etal. Noninvasive evaluation of a novel swine model of renal artery stenosis[J]. J Am Soc Nephrol, 1999, 10(7): 1455-1465.

[16] Torres-Rovira L,Astiz S,Caro A,etal. Diet-induced swine model with obesity/leptin resistance for the study of metabolic syndrome and type 2 diabetes[J]. ScientificWorldJournal, 2012, 2012: 510149.

《西部醫(yī)學(xué)》2016年各期重點內(nèi)容安排

期次重點內(nèi)容期次重點內(nèi)容期次重點內(nèi)容期次重點內(nèi)容1呼吸 感染4影像 介入7消化 普外10內(nèi)分泌 血液2泌尿 男科5婦產(chǎn) 兒科8骨科 創(chuàng)傷11風(fēng)濕免疫 病理3心內(nèi) 心外6神內(nèi) 神外9腫瘤 血管外12急診與重癥醫(yī)學(xué)

注：請廣大作者按各期重點內(nèi)容至少提前6個月投送符合本刊要求的學(xué)術(shù)論文

(本刊編輯部)

Analysis of a novel mini-pig model of spontaneous hypertension and target organ damage

WEI Shujie,ZHANG Yan, YANG Yongjian,etal

(DepartmentofCardiology,ChengduMilitaryGeneralHospital,Chengdu610083,China)

Objective To establish and evaluate a novel model of hypertensive mini-pig, and analyze the related target organs damage. Methods The blood pressure (BP) of 6、12、18 months Guizhou mini-pigs(n=5) and domestic pigs(n=5) were measured. At the age of 18 months, The plasma glucose, hemoglobin A1c (HbA1c) and lipid profiles including triglycerides, total cholesterol, low-density lipoprotein (LDL) cholesterol and high-density lipoprotein (HDL) cholesterol of both groups were assessed. The plasma concentrations of epinephrine (E), norepinephrine (NE), dopamine and urine vanilmandelic acid (VMA) of the two groups were measured using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kits. The plasma renin activity and the plasma levels of angiotensin (ANG) Ⅰ, Ⅱ, and aldosterone were assayed by radioimmunoassay. The heart and kidney of two groups were stained with H&E, Masson trichrome. Results The BP of 6, 12, 18 months Guizhou mini-pigs are significantly higher than the same age domestic pigs(P<0.01). The serum TC(3.11±0.09)mmol/L、TG(0.62±0.04)mmol/L, LDL(1.81±0.05)mmol/L of the 18 months of Guizhou mini-pigs were higher than that of domestic pig (allP<0.05). Moreover, the serum E, NE, DA and urine VMA level of Guizhou mini-pigs were (6968.68±426.10) pg/ml, (20.21±0.91)ng/ml, (27404.26±4257.96)pg/ml and (61.36±2.14)ng/ml, which were significantly higher than domestic pigs(allP<0.01).The H&E and Masson trichrome stain results show that The mini-pigs demonstrated a significant cardiac hypertrophy and a slight fibrosis and mild renal fibrosis as compared with domestic pigs. Conclusion The Guizhou mini-pig is a novel hypertensive animal model with sympathetic hyperactivity.

Mini-pig； Hypertension； Target organ damage

國家自然科學(xué)基金(81070191、81500224)；全軍醫(yī)學(xué)科技青年培育項目(13QNP058)；成都軍區(qū)總醫(yī)院院管課題(2013YG-B073)

楊永健，博士后，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，本刊常務(wù)編委，E-mail：yangyongjian38@sina.com

R 544.1

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.009

2015-12-01； 修回日期： 2016-02-03; 編輯： 母存培)