冉斌 岳榮川 胡厚祥 張榮驛 劉思 劉杰 陳海燕 譚春燕

丹參多酚保護(hù)線粒體功能減輕H2O2誘導(dǎo)的成年小鼠心肌細(xì)胞損傷*

冉斌1,2岳榮川1胡厚祥1張榮驛1劉思1劉杰1陳海燕1譚春燕1

( 1. 川北醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院心內(nèi)科, 四川 南充 637000 ；2. 江油市人民醫(yī)院心內(nèi)科, 四川 江油 621700)

目的 探討丹參多酚減輕心肌細(xì)胞損傷的作用及機(jī)制。方法 將原代培養(yǎng)的成年小鼠心肌細(xì)胞分為4組：對(duì)照組(換MEM細(xì)胞培養(yǎng)液)、丹參多酚組(用含有5g/L丹參多酚的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞3小時(shí))、H2O2組(用含有25 μM H2O2的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞3小時(shí)來(lái)誘導(dǎo)成年小鼠心肌細(xì)胞的損傷)及丹參多酚+H2O2組(用同時(shí)含有5g/L丹參多酚及25 μM H2O2的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液處理細(xì)胞3小時(shí))。檢測(cè)4個(gè)不同處理組中細(xì)胞活力、細(xì)胞內(nèi)ATP水平、線粒體體膜電位的變化。結(jié)果 與對(duì)照組相比，H2O2組中的細(xì)胞存活率明顯下降，細(xì)胞內(nèi)ATP水平顯著降低，線粒體膜電位也明顯下降(均P<0.05)。而丹參多酚能明顯抑制H2O2引起的細(xì)胞存活率下降、細(xì)胞內(nèi)ATP水平的降低以及線粒體膜電位的下降(均P<0.05)。 結(jié)論 丹參多酚可以對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用，其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制可能與其減輕線粒體功能障礙有關(guān)。

丹參多酚； 成年小鼠心肌細(xì)胞； 線粒體功能

心血管疾病已經(jīng)成為影響人類(lèi)健康的第一位疾病，且其發(fā)病率仍然呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)[1]。心肌細(xì)胞的凋亡與壞死導(dǎo)致的心肌細(xì)胞丟失是多種心血管疾病發(fā)生的共同病理生理機(jī)制[2]。成年心肌細(xì)胞被認(rèn)為是一種自我再生能力極低的細(xì)胞，一旦丟失往往難以得到有效的補(bǔ)充[3]。因此，如何積極有效地保護(hù)心肌細(xì)胞免于各種病理?yè)p傷一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者致力于研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。

傳統(tǒng)的中藥丹參多酚在中國(guó)已經(jīng)廣泛而成功地應(yīng)用于治療各種心腦血管疾病[4～6]，但其確切機(jī)制仍不清楚，需要進(jìn)一步研究。前期研究發(fā)現(xiàn)，線粒體功能障礙是細(xì)胞走向凋亡的重要的共同途徑[7, 8]。因此我們推測(cè)，丹參多酚的保護(hù)作用可能與其減輕線粒體功能障礙從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，我們用H2O2處理成年心肌細(xì)胞，造成細(xì)胞損傷，觀察丹參多酚是否對(duì)損傷的心肌細(xì)胞具有直接的保護(hù)作用，同時(shí)通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ATP水平及線粒體膜電位等指標(biāo)，觀察丹參多酚的保護(hù)作用是否與減輕線粒體功能障礙有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 成年小鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng) 根據(jù)我們之前的方法[9]分離和培養(yǎng)成年小鼠心肌細(xì)胞：取出小鼠心臟后立即采用主動(dòng)脈逆灌注方法灌流緩沖液，然后灌流消化酶消化分離細(xì)胞，梯度復(fù)鈣，細(xì)胞預(yù)貼壁1小時(shí)后，換培養(yǎng)液在37℃ 2%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時(shí)換液。

1.2 細(xì)胞分組 分離的成年小鼠心肌細(xì)胞隨機(jī)分成4組：① 對(duì)照組：更換MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，3小時(shí)(37℃)后檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。② 丹參多酚組：更換含有5g/L丹參多酚[10]的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，3小時(shí)(37℃)后檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。③ H2O2組：更換含有25 μM H2O2的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液[9]，3小時(shí)(37℃)后檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。 ④ 丹參多酚+H2O2組：更換同時(shí)含有5g/L丹參多酚[10]及25 μM H2O2的MEM細(xì)胞培養(yǎng)液，3小時(shí)(37℃)后檢測(cè)相應(yīng)的指標(biāo)。

1.3 細(xì)胞中ATP水平檢測(cè) 細(xì)胞中ATP水平是反應(yīng)線粒體功能的一項(xiàng)重要指標(biāo)。根據(jù)我們之前實(shí)驗(yàn)方法[11, 12]，按ATP檢測(cè)試劑盒操作步驟進(jìn)行檢測(cè)。以對(duì)照組作為標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行相對(duì)量的比較。

1.4 細(xì)胞中線粒體膜電位檢測(cè) 根據(jù)我們之前的實(shí)驗(yàn)方法[11, 12]，用JC-1探針檢測(cè)線粒體膜電位。在線粒體膜電位較高時(shí)，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時(shí)，JC-1 不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時(shí)JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。具體步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，染色結(jié)束立即于激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照，同時(shí)通過(guò)多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)綠光(490/530 nm)和紅光(525/590 nm)吸光值進(jìn)行定量比較。

2 結(jié)果

2.1 丹參多酚對(duì)成年小鼠心肌細(xì)胞存活率的影響 采用H2O2處理成年小鼠心肌細(xì)胞來(lái)模擬心肌細(xì)胞損傷的體外模型，可以看到H2O2會(huì)引起細(xì)胞死亡(桿狀細(xì)胞為活細(xì)胞，蜷縮成團(tuán)狀細(xì)胞為死細(xì)胞，圖1)。與對(duì)照組比較[(87.4±2.6)%]，H2O2組細(xì)胞存活率[(46.6±3.6)%]明顯降低(P<0.05)，而加入丹參多酚[(68.6±3.2)%]能明顯增加細(xì)胞對(duì)H2O2損傷的耐受(P<0.05)。

圖1 丹參多酚對(duì)成年小鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)作用

Figure 1 The protective effects of salvianolate on adult mice cardiomyocytes

注：n=6, 與對(duì)照組比較，①P<0.05；與H2O2組比較，②P<0.05

2.2 丹參多酚對(duì)成年小鼠心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平的影響 細(xì)胞內(nèi)ATP水平是反應(yīng)細(xì)胞線粒體功能的重要指標(biāo)，用H2O2處理成年小鼠心肌細(xì)胞后，我們可以看到細(xì)胞內(nèi)的ATP水平[(46.5±4.2)%]較對(duì)照組(100%)明顯降低(P<0.05)，說(shuō)明氧化應(yīng)激引起了線粒體功能障礙，而加入丹參多酚[(68.7±4.8)%]能明顯抑制H2O2引起ATP水平的下降(P<0.05)，圖2。

圖2 丹參多酚抑制H2O2引起的心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平的下降

Figure 2 Salvianolate prevented the reduction of ATP in cardiomyocytes induced by H2O2

注：n=6, 與對(duì)照組比較，①P<0.05 ； 與H2O2組比較，②P<0.05

圖3 丹參多酚抑制H2O2引起的線粒體膜電位下降

Figure 2 Salvianolate prevented the reduction of mitochondrial membrane potential induced by H2O2

注：n=6, 與對(duì)照組比較，①P<0.05； 與H2O2組比較，②P<0.05

2.3 丹參多酚對(duì)成年小鼠心肌細(xì)胞線粒體膜電位的影響 線粒體膜電位是反應(yīng)線粒體功能的重要指標(biāo)，我們通過(guò)JC-1探針來(lái)檢測(cè)線粒體膜電位的變化。激光共聚焦顯微鏡下可以看到H2O2處理組中成年心肌細(xì)胞的紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)；用酶標(biāo)儀測(cè)各組紅光與綠光比值并與對(duì)照組比較也明顯降低，說(shuō)明H2O2處理組細(xì)胞中線粒體膜電位[(35.6±5.1)%]與對(duì)照組(100%)相比明顯降低(P<0.05)。而加入丹參多酚后通過(guò)激光共聚焦顯微鏡可以看到細(xì)胞的紅色熒光較雙氧水組增強(qiáng)，綠色熒光較H2O2組減弱。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各組紅光與綠光比值發(fā)現(xiàn)，加入丹參多酚后線粒體膜電位[(60.0±7.2)%]較H2O2組[(35.6±5.1)%]明顯升高(P<0.05)。

3 討論

傳統(tǒng)中藥丹參多酚在中國(guó)被廣泛應(yīng)用于治療各種心腦血管疾病，如冠心病[4]、腦梗死[13]等。多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí)其在心血管疾病中的保護(hù)作用。Han B等的研究結(jié)果表明，丹參多酚能夠減輕豬心肌的缺血/再灌注損傷[14]。Meng C等的研究結(jié)果表明，丹參多酚能夠通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥減輕大鼠的動(dòng)脈粥樣硬化[15]。另有研究表明，丹參多酚能夠減輕豬急性心肌梗死后氧化應(yīng)激指標(biāo)，降低腦鈉肽的水平[16]。這些數(shù)據(jù)充分證明丹參多酚對(duì)心臟的保護(hù)作用，但其具體的保護(hù)機(jī)制仍不是很清楚。

線粒體功能障礙引起的心肌細(xì)胞凋亡是心血管疾病中多種病理生理變化的共同途徑[17～19]。心肌細(xì)胞再生能力極低，心肌細(xì)胞凋亡導(dǎo)致有效的心肌細(xì)胞丟失，最終會(huì)導(dǎo)致心臟重塑及心衰的發(fā)生[3, 20]。因此如何有效保護(hù)線粒體功能，減少心肌細(xì)胞凋亡，從而最大限度地減少心肌細(xì)胞的丟失，對(duì)于延緩心衰的進(jìn)展具有重要意義。有研究表明，丹參多酚具有抗氧作用[10, 16, 21]，因此它可能會(huì)通過(guò)減輕氧化應(yīng)激對(duì)線粒體功能起到保護(hù)作用。

在本實(shí)驗(yàn)中，我們通過(guò)H2O2刺激對(duì)體外培養(yǎng)的成年小鼠心肌細(xì)胞造成損傷，觀察丹參多酚的保護(hù)作用，發(fā)現(xiàn)丹參多酚可以有效減少H2O2引起的成年小鼠心肌細(xì)胞的死亡。說(shuō)明丹參多酚可以直接對(duì)心肌細(xì)胞起到保護(hù)作用。同時(shí)為了進(jìn)一步探討丹參多酚的保護(hù)機(jī)制，我們同時(shí)對(duì)各組心肌細(xì)胞中的ATP水平及線粒體膜電位進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)丹參多酚可以抑制H2O2引起的心肌細(xì)胞內(nèi)ATP水平的下降以及線粒體膜電位的降低，說(shuō)明丹參多酚可以減輕H2O2引起的線粒體功能障礙，其對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用與其減輕線粒功能障礙有關(guān)。但其保護(hù)線粒體功能的具體機(jī)制還有待于進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論與啟示

丹參多酚可以減輕H2O2引起的成年小鼠心肌細(xì)胞損傷，說(shuō)明丹參多酚可以直接對(duì)心肌細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用，其保護(hù)心肌細(xì)胞的作用與其能夠減輕線粒體功能障礙有關(guān)。

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Salvianolate protects against H2O2-induced adult mice cardiomyocytes injury by precenting mitochondrial dysfunction

RAN Bin，YUE Rongchuan,HU Houxiang,etal

(DepartmentofCardiology,NorthSichuanMedicalCollegeAffiliatedHospital，Nanchong637000,Sichuan,China;DepartmentofCardiology，JiangyouPeople’sHospital,Jiangyou621700,Sichuan,China)

Objective To investigate the protective role and mechanism of salvianolate on cardiac myocytes injury. Methods The primary cultured adult mouse cardiomyocytes were divided into control group, salvianolate group, cardiomyocytes exposed to MEM containing 5g/L salvianolate for 3 hours. H2O2group, cardiomyocytes exposed to MEM with 25μM H2O2for 3 hours and the salvianolate + H2O2group, cardiomyocytes were treated with MEM containing 5g/L salvianolate and 25μM H2O2. Then, the survival of cardiomyocytes was counted. The intracellular ATP and the mitochondrial membrane potential were determined in these groups. Results Compared with control, the survival of cardiomyocytes was significantly decreased and the intracellular ATP and mitochondrial membrane potential were also significantly decreased in the H2O2group(P<0.05). However, these effects of H2O2on cardiomyocytes were abolished by salvianolate (P<0.05). Conclusion Salvianolate could alleviate adult mice cardiomyocytes injury by preventing mitochondrial dysfunction.

Salvianolate； Adult mice cardiomyocytes； Mitochondrial function

國(guó)家自然科學(xué)基金(81070101)

胡厚祥，教授，本刊編委，E-mail：hhxiang17@163.com

R-33

A

10.3969/j.issn.1672-3511.2016.03.006

2015-12-01； 編輯： 母存培)