張亞萍，王斌達(dá)，劉春艷，葉指南，唐維國，吳舟娜，何松彬（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院　神經(jīng)內(nèi)科，浙江　舟山　316000）

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急性腦梗死超早期血液生物標(biāo)志物β-actin的表達(dá)及臨床意義

張亞萍，王斌達(dá)，劉春艷，葉指南，唐維國，吳舟娜，何松彬
（溫州醫(yī)科大學(xué)附屬舟山醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，浙江舟山316000）

[摘 要]目的：探討急性腦梗死超早期（發(fā)?。? h）血液β-actin的表達(dá)狀態(tài)及臨床意義。方法：收集急性腦梗死患者80例，設(shè)立為急性腦梗死組，并且按不同發(fā)病時(shí)段，分為腦梗死2 h組、腦梗死4 h組、腦梗死6 h組、腦梗死24 h組及腦梗死72 h組，每組16例；并且與非腦梗死組進(jìn)行對照比較。非腦梗死組包括短暫性腦缺血發(fā)作組、腦出血組及健康人群組，每組16例。采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血液β-actin的表達(dá)狀態(tài)，并與臨床病情結(jié)合進(jìn)行分析。結(jié)果：①急性腦梗死組的血液β-actin含量為（4.24±2.74）ng/mL，明顯高于非腦梗死組的（2.25±1.65）ng/mL，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；其中，腦梗死2 h組血液β-actin含量與非腦梗死人群各組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；②通過ROC曲線確定血液生物標(biāo)志物β-actin早期診斷急性腦梗死的截?cái)嘀禐?.10 ng/mL時(shí)，具有較高的靈敏度和一定的特異度；③急性腦梗死組血液β-actin水平與梗死面積大小以及NIHSS評分呈一定相關(guān)性。結(jié)論：急性腦梗死超早期血液β-actin的表達(dá)升高可能是一種實(shí)用的血清生物標(biāo)志物。

[關(guān)鍵詞]急性腦梗死；超早期；β-actin；生物標(biāo)志物

應(yīng)用血清生物標(biāo)志物診斷腦梗死、預(yù)測神經(jīng)功能惡化及梗死出血轉(zhuǎn)化是目前腦血管病的研究熱點(diǎn)。至今為止，還沒有一項(xiàng)生物標(biāo)志物被國際認(rèn)可用于腦梗死診斷及臨床應(yīng)用，尤其在急性超早期腦梗死的診斷方面。前期曾經(jīng)應(yīng)用iTRAQ（同位素相對標(biāo)記與絕對定量）技術(shù)對急性腦梗死血清標(biāo)志物進(jìn)行了篩選研究，發(fā)現(xiàn)血液生物標(biāo)志物β-actin在急性超早期腦梗死中有較特異的表達(dá)。為了驗(yàn)證這一發(fā)現(xiàn)，本項(xiàng)目對80例不同發(fā)病時(shí)期的急性腦梗死及48例非急性腦梗死血液樣本進(jìn)行β-actin檢測及分析，以期探索β-actin作為急性腦梗死血液生物標(biāo)志物的可能性。

1　對象和方法

1.1研究對象 選取2011年1月至2013年1月收治我院神經(jīng)內(nèi)科的急性腦梗死患者共80例，其中男48例，女32例，年齡52～83歲，平均（70.88±10.01）歲，作為急性腦梗死組。納入標(biāo)準(zhǔn)：急性前循環(huán)腦梗死，診斷符合1996年第四屆腦血管病會議診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，并經(jīng)CT或MRI確診。急性腦梗死組根據(jù)不同發(fā)病時(shí)間分為5小組：腦梗死2 h組（抽血時(shí)間距腦梗死發(fā)病2 h）、腦梗死4 h組（抽血時(shí)間距腦梗死發(fā)病4 h）、腦梗死6 h組（抽血時(shí)間距腦梗死發(fā)病6 h）、腦梗死24 h組（抽血時(shí)間距腦梗死發(fā)病24 h）、腦梗死72 h組（抽血時(shí)間距腦梗死發(fā)病72 h），每組各16例；排除標(biāo)準(zhǔn)：排除急性后循環(huán)腦梗死、腦出血、腦外傷及腦腫瘤患者。非腦梗死組分3小組，包括短暫性腦缺血發(fā)作組、腦出血組及健康人群組。選取同期收治我院神經(jīng)內(nèi)科的短暫腦缺血性發(fā)作2 h患者16例為短暫性腦缺血發(fā)作組，其中男10例，女6例，年齡53～88歲，平均（71.63±12.75）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)詳細(xì)詢問病史、嚴(yán)格的神經(jīng)系統(tǒng)檢查并由頭顱CT、MRI證實(shí)無腦出血及腦梗死，診斷符合1996年第四屆腦血管病會議診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]。選取同期腦出血發(fā)病2 h患者16例為腦出血組，其中男12例，女4例，年齡49～87歲，平均（67.88±11.02）歲；納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)頭顱CT證實(shí)，診斷符合1996年第四屆腦血管病會議診斷標(biāo)準(zhǔn)[1]，美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分與腦梗死2 h組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。排除標(biāo)準(zhǔn)：影像學(xué)檢查提示繼發(fā)于腦內(nèi)異常結(jié)構(gòu)的腦出血；6個(gè)月內(nèi)有缺血性腦卒中發(fā)作的病史；腦動脈瘤破裂出血；外傷后腦出血；單純腦室出血等。健康人群組選自健康社區(qū)志愿者16例，男6例，女10例，年齡5O～81歲，平均（65.14±l1.13）歲。各非腦梗死組與腦梗死組的年齡、性別匹配，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會同意并簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑和儀器：采用actin酶聯(lián)免疫試劑盒（由美國BPD公司生產(chǎn)提供），試劑檢測的靈敏度為1 ng/mL。酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（EIISA）檢測用儀器為英國產(chǎn)DENLEY-MK-2型全自動酶標(biāo)分析儀。

1.2.2標(biāo)本采?。好總€(gè)病例和對照均采用真空管抽取3 mL周圍靜脈血。采集1次靜脈血3 mL，冰盒取回后4 ℃冰箱靜置1 h，3 000 r/min、4 ℃離心10 min，取上清分裝后于-80 ℃冰箱保存，待檢。采血時(shí)間：腦梗死、腦出血及短暫性腦缺血發(fā)作患者為發(fā)病各時(shí)間點(diǎn)急診就診時(shí)，健康人群組為凌晨空腹。

1.2.3檢測方法：采用ELISA法對β-actin進(jìn)行檢測，檢測時(shí)實(shí)驗(yàn)操作及結(jié)果報(bào)告均嚴(yán)格按照試劑盒操作說明書進(jìn)行。

1.2.4梗死面積分類方法：按Adamas標(biāo)準(zhǔn)梗死面積直徑＞5 cm并累及2個(gè)以上大血管供血區(qū)，梗死區(qū)面積達(dá)到20 cm2或累及2個(gè)以上解剖部位的梗死定為大面積腦梗死。其余為中、小面積梗死。

1.2.5神經(jīng)功能缺損程度評定：應(yīng)用NIHSS進(jìn)行評定，以發(fā)病72 h以內(nèi)的神經(jīng)功能缺損程度評定為準(zhǔn)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS21．0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用±s表示，2組均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多個(gè)組間比較采用單因素方差分析，相關(guān)分析采用Spearman等級相關(guān)分析。利用ROC曲線確定最優(yōu)截?cái)帱c(diǎn)，計(jì)算ROC曲線下面積、靈敏度和特異度。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1急性腦梗死組與非腦梗死組血液生物標(biāo)志物β-actin比較 血清生物標(biāo)志物β-actin在急性腦梗死組的含量明顯高于非腦梗死組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1　急性腦梗死組與非腦梗死組比較（±s）

表1　急性腦梗死組與非腦梗死組比較（±s）

與非腦梗死組比：aP＜0.05

組別　例數(shù)　β-actin（ng/mL）急性腦梗死組　80　4.24±2.74a非腦梗死組　48　2.25±1.65a

2.2急性腦梗死不同時(shí)段分組與非腦梗死分組血液生物標(biāo)志物β-actin比較 腦梗死發(fā)病2 h血液β-actin水平與各對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜0.05），見表2。

2.3血液生物標(biāo)志物β-actin診斷早期急性腦梗死的靈敏度及特異度分析 通過ROC曲線確定血清生物標(biāo)志物β-actin診斷急性腦梗死的截?cái)嘀禐?.10 ng/mL時(shí)，診斷腦梗死的靈敏度為83.8%，特異度為62.5%。分組靈敏度腦梗死2 h組為87.5%，腦梗死4 h組為100.0%，腦梗死6 h組為81.3%，腦梗死24 h組為75.0%，腦梗死72 h組為68.8%，見圖1。

表2　急性腦梗死不同時(shí)段分組與非腦梗死分組比（±s）

表2　急性腦梗死不同時(shí)段分組與非腦梗死分組比（±s）

與短暫性腦缺血發(fā)作組比：aP＜0.05；與腦出血組比：bP＜0.05；與健康人群組比：cP＜0.05

組別　例數(shù)　抽血時(shí)間　β-actin（ng/mL）腦梗死2 h組　16　發(fā)病2 h　3.95±1.18abc腦梗死4 h組　16　發(fā)病4 h　5.74±3.36cab腦梗死6 h組　16　發(fā)病6 h　3.56±2.28cab腦梗死24 h組　16　發(fā)病24 h　4.38±2.83bab腦梗死72 h組　16　發(fā)病72 h　3.58±3.20cab短暫性腦缺血發(fā)作組　16　發(fā)病2 h　2.19±1.28cab腦出血組　16　發(fā)病2 h　2.02±1.34cab健康人群組　16　凌晨空腹　2.52±2.22cab

圖1　以急性腦梗死組和非腦梗死組為分析人群，將所有可能的切點(diǎn)作為閾值進(jìn)行靈敏度和特異度計(jì)算，作出ROC曲線，曲線下面積為0.746，說明診斷具有一定的準(zhǔn)確性

2.4不同范圍腦梗死與血液生物標(biāo)志物β-actin表達(dá)的關(guān)系 大面積腦梗死組血液β-actin表達(dá)水平比中、小面積腦梗死組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman等級相關(guān)分析顯示血液β-actin水平與不同范圍腦梗死存在一定正相關(guān)性（r=0.792，P＜0.05），見表3。

表3　不同范圍腦梗死血液β-actin水平的比較（±s）

表3　不同范圍腦梗死血液β-actin水平的比較（±s）

組別　例數(shù)　β -a c t i n （n g / m L）中、小面積腦梗死組　2 9 　3 .4 1 ± 1 .8 9a大面積腦梗死組　5 1 　4 .5 2 ± 1 .7 4a

2.5不同NIHSS評分與血液生物標(biāo)志物β-actin表達(dá)的關(guān)系 將急性腦梗死組依據(jù)NIHSS評分分為＜5分、5～10分及＞10分組，3組血液β-actin水平比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。＜5分組與5～ 10分組比，5～10分組與＞10分組比，＜5分組與＞10分組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。Spearman等級相關(guān)分析顯示血液β-actin水平與NIHSS評分呈一定相關(guān)性（r=0．653，P＜0.05），見表4。

表4　不同范圍腦梗死NIHSS評分與血液β-actin水平的比較（±s）

表4　不同范圍腦梗死NIHSS評分與血液β-actin水平的比較（±s）

與5～10分組比：aP＜0.05；與＞10分組比：bP＜0.05

組別　例數(shù)　β-actin（ng/mL）＜5分組　19　2.14±1.37ab5～10分組　35　3.81±1.58bb＞10分組　26　4.79±2.53bb

3　討論

應(yīng)用血液生物標(biāo)志物診斷急性腦梗死目前主要有兩個(gè)研究方向：①成組生物標(biāo)志物的應(yīng)用研究。成組生物標(biāo)志物的應(yīng)用可以彌補(bǔ)單一生物標(biāo)志物的不足，目前有多項(xiàng)成組生物標(biāo)志物的研究報(bào)道[2]。但是在這些成組生物標(biāo)志物的研究報(bào)道中，沒有一項(xiàng)進(jìn)行過回歸方程式研究以及大范圍多病種的有效性驗(yàn)證，也沒有提出一項(xiàng)可以在臨床上操作應(yīng)用的血清學(xué)診斷模式[3]。②在更廣范圍內(nèi)尋找一種或多種新的血液生物標(biāo)志物來早期診斷急性腦梗死[4]。基于前期應(yīng)用iTRAQ技術(shù)對急性腦梗死血清標(biāo)志物進(jìn)行的篩選研究，發(fā)現(xiàn)血液生物標(biāo)志物β-actin在急性超早期腦梗死有較特異的表達(dá)。本研究采用ELISA法檢測急性腦卒中患者血液中的β-actin，發(fā)現(xiàn)急性腦梗死患者血液β-actin含量明顯高于腦出血組、短暫性腦缺血發(fā)作組及健康人群組。

β-actin是腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞骨架蛋白的重要構(gòu)成成分，由跨膜蛋白和胞質(zhì)附著蛋白組成的連接復(fù)合物固定在細(xì)胞內(nèi)，在細(xì)胞連接和細(xì)胞屏障功能上發(fā)揮著重要的作用[5]。β-actin主要有兩種存在形式，包括胞內(nèi)呈聚合態(tài)的F-actin和胞漿中游離態(tài)的G-actin，其中F-actin呈纖維狀，是構(gòu)成細(xì)胞骨架的主要部分，G-actin則為單體分子球形蛋白。有研究顯示缺氧/復(fù)氧導(dǎo)致血腦屏障通透性增高，同時(shí)F-actin、Occludin以及ZO-1的表達(dá)量也增加，尤其以F-actin升高最為顯著[6-7]。但也有研究發(fā)現(xiàn)在缺氧/低糖對體外模型腦內(nèi)皮細(xì)胞的刺激實(shí)驗(yàn)中，骨架蛋白actin結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，但是actin在腦內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)卻是減少的[8]。我們推測這一現(xiàn)象可能與早期急性腦梗死缺血低氧中血腦屏障的通透性發(fā)生改變[9-12]，腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞因缺血低氧而致細(xì)胞膜通透性增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的β-actin大量釋放入血有關(guān)，也可能與血腦屏障的時(shí)序開放相關(guān)[13]。結(jié)合本項(xiàng)研究的觀察結(jié)果，有理由認(rèn)為：血液β-actin的表達(dá)升高可能是診斷超早期急性腦梗死的一個(gè)生物標(biāo)志物，且具有較高靈敏度和一定特異度。

本研究還發(fā)現(xiàn)，急性腦梗死發(fā)病2 h組血液β-actin含量分別與短暫性腦缺血發(fā)作、腦出血組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。為此我們推測急性腦梗死、短暫性腦缺血發(fā)作及腦出血三者在發(fā)病2 h時(shí)，對血腦屏障的影響是不一樣的。急性腦梗死與短暫性腦缺血發(fā)作雖然都是大腦血管的缺血，但是它們的缺血時(shí)間不同，所產(chǎn)生的后果也有所不同。一般而言，短暫性腦缺血發(fā)作持續(xù)時(shí)間不超過1 h，如果超過1 h大腦就會出現(xiàn)不可逆的損害，而不可逆的損害發(fā)生可能與血腦屏障緊密連接發(fā)生不可逆的變化有關(guān)。另外，腦出血對血腦屏障的影響可能與血液中凝血酶等因子毒性刺激有關(guān)[14]，與急性腦梗死引起的腦血管缺血有所不同。通過分析有理由認(rèn)為：急性腦梗死2 h時(shí)血液β-actin的表達(dá)升高可能是一個(gè)特征性的變化，這一變化可以有效區(qū)分急性腦梗死與短暫性腦缺血發(fā)作、腦出血。

其次，我們通過ROC曲線確定血液生物標(biāo)志物β-actin診斷急性腦梗死的臨界值為＞2.10 ng/mL時(shí)，診斷急性腦梗死平均靈敏度為83.8%，特異度為62.5%。其中分組靈敏度以腦梗死2 h組和腦梗死4 h組較高，最高達(dá)100.0%。由此說明通過測定血液β-actin水平來發(fā)現(xiàn)早期的腦梗死具有較高的靈敏度及一定的特異度。此外，大面積腦梗死患者血液β-actin表達(dá)水平比中小面積腦梗死患者高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，相關(guān)分析示血液β-actin水平與不同面積腦梗死及神經(jīng)功能缺損程度（NIHSS評分）存在一定的正相關(guān)性。急性腦梗死血腦屏障損害相關(guān)標(biāo)志物β-actin，可能是一種實(shí)用的急性腦梗死生物標(biāo)志物。對這一問題的深入研究，將為臨床利用血清生物標(biāo)志物診斷早期急性腦梗死提供新的思路。

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（本文編輯：吳彬）

·論著·

Expression and clinical significance of ultra early stage biomarker blood β-actin in patient with acute cerebral infarction

ZHANG Yaping,WANG Binda,LIU Chunyan,YE Zhinan,TANG Weiguo,WU Zhouna,HE Songbin.Department of Neurology,Zhoushan Hospital Affiliated to Wenzhou Medical University,Zhoushan,316000

Abstract:Objective:To explore the expression level of blood β-actin and its clinical significance in ultra early stage of acute cerebral infarction.Methods:Eighty patients with acute cerebral infarction (ACI) were selected as cerebral infarction group,and they were divided into five subgroups by different periods (2 hours,4 hours,6 hours,24 hours and 72 hours),16 patients in each subgroup.Other 48 cases without cerebral infarction were selected as control group,including 16 cases of transient ischemic attack,16 cases of cerebral hemorrhage and 16 cases of healthy contrast group.The content of blood β-actin was detected by enzyme-linked immunosorbent method and analyzed combined with clinical condition.Results:①The content of blood β-actin in the cerebral infarction group was significantly higher than those in the control group (P＜0.05).②The diagnostic kit for ACI was determined at 2.10 ng/mL by ROC curve.It had high sensitivity and specificity.③The level of blood β-actin in patients with acute cerebral infarction has certain correlation with the area of cerebra1 infarction as well as NIHSS scores.Conclusion:The elevated level of blood β-actin may be a practical biomarker of acute cerebral infarction in ultra early stage.

Key words:acute cerebral infarction; ultra early stage; β-actin; biomarker

通信作者：何松彬，主任醫(yī)師，Email：1998hsb@163.com。

作者簡介：張亞萍（1987-），女，浙江臺州人，碩士生。

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（Y2111264）；浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生一般研究計(jì)劃項(xiàng)目（2012KYB224）；舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（10141）。

收稿日期：2015-07-25

[中圖分類號]R743.33

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.004