趙佳麗　張磊　張素芳　王艷紅　張含國

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

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基于轉(zhuǎn)錄組學測序的長白落葉松材性表達基因1)

趙佳麗張磊張素芳王艷紅張含國

(林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，哈爾濱，150040)

摘要基于邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis，SBS)技術(shù)，使用Illumina HiSeq2500高通量測序平臺對長白落葉松cDNA文庫進行測序。共獲得非重復序列基因58 683條，總長度為55 283 938 bp。將得到的轉(zhuǎn)錄本使用BLAST軟件將非重復序列基因序列與NR、Swiss-Prot、GO、COG、KEGG數(shù)據(jù)庫比對，通過選擇BLAST參數(shù)E-value不大于10(-5)，最終獲得29 350個有注釋信息的基因序列，其中19 292個轉(zhuǎn)錄本注釋GO編號，有9 112個轉(zhuǎn)錄本在COG數(shù)據(jù)庫中被注釋并分為25個功能分類，同時注釋到120條KEGG代謝途徑。在得到注釋的轉(zhuǎn)錄本中搜索到木質(zhì)素相關(guān)基因共68條，其中與木質(zhì)素合成相關(guān)基因29條，與木質(zhì)素分解代謝相關(guān)基因27條；找到了147條纖維素相關(guān)基因，其中與纖維素合成相關(guān)基因103條，與纖維素分解代謝相關(guān)基因44條。

關(guān)鍵詞長白落葉松；轉(zhuǎn)錄組；高通量測序；材性基因

分類號S791.225

Gene Expression of Wood Properties Based on Transcriptome ofLarixolgensis

Zhao Jiali, Zhang Lei, Zhang Sufang, Wang Yanhong, Zhang Hanguo

(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding, Northeast Forestry University, Harbin 150040, P. R. China)//Journal of Northeast Forestry University，2016,44(4)：8-12.

Based on sequencing-by-synthesis (Sequencing By Synthesis, SBS) technology, we used Illumina HiSeq2500 high-throughput sequencing to perform the cDNA libraryLarixolgensisfor sequencing platform. We acquired 58 683 Unigenes, and the total length was 55 283 938 bp. We used BLAST software to compare Unigenes sequence of transcript with NR, Swiss-Prot, GO, COG, KEGG database.The parameter of E-value was not more than 10-5with 29 350 annotated Unigenes. Among them, 19 292 annotations was from GO, 9 112 from COG, and these Unigenes was divided into 25 functional categories, 120 from KEGG. There were 68 Unigenes connected with lignin biosynthesis in the annotated transcripts. The Unigenes related to lignin biosynthesis was 29, and the Unigenes related to lignin catabolism was 27. We found 147 Unigenes related to cellulose. The Unigenes related to cellulose biosynthesis was 103, and the Unigenes related to cellulose catabolism was 44.

KeywordsLarixolgensis； Transcriptome； High throughput sequencing； Wood properties

轉(zhuǎn)錄組(Transcriptome)[1]廣義上指在特定環(huán)境或生理條件下的一個細胞、組織或生物體中所有表達基因的總和。轉(zhuǎn)錄組學是一門在整體水平上研究某一時刻某一細胞中基因全部轉(zhuǎn)錄本種類、結(jié)構(gòu)和功能及轉(zhuǎn)錄調(diào)控規(guī)律的學科，其目的在于提供構(gòu)成生物全部基因的表達調(diào)節(jié)系統(tǒng)和全部蛋白質(zhì)的功能、相互作用等信息，以及解析生物細胞功能的全部情況[2]。隨著后基因組時代的到來，轉(zhuǎn)錄組學是最先發(fā)展并且應用最廣泛的技術(shù)[3]。因此,轉(zhuǎn)錄組學可用來比較不同組織或不同生理狀態(tài)下生物組織基因表達的整體差異，可以高效地發(fā)掘與特定生理功能、生源途徑相關(guān)的相關(guān)功能基因,并且推測未知基因，對研究特定生物學過程具有重要意義。

近年來，轉(zhuǎn)錄組在林木中的應用研究十分廣泛，特別是毛果楊，其具有基因組小、生長迅速等特點,成為了林木基因組學研究的模式植物[4]。Alexander A M et al.[5]對巨桉的基因組測序也已經(jīng)完成。雖然針葉樹基因組巨大，相比較其他物種重復序列多，世代周期長，研究滯后于模式植物和作物，但近年來對針葉樹基因組研究中也發(fā)現(xiàn)了許多功能基因，對針葉樹基因組的發(fā)展起到了推動作用[6]。Thomas et al.[7]對黑松的轉(zhuǎn)錄組進行組裝和注釋，以及其潛在的分子標記開發(fā)，有助于研究其他松樹。Aleksey Zimin et al.[8-10]采用新的方法確定火炬松的基因組序列，火炬松的全基因組測序約為人類基因組的七倍，是目前已完成測序的最大基因組，在發(fā)表過的針葉樹基因組序列中也是最完整的。

同樣轉(zhuǎn)錄組學被應用于基因的開發(fā)與挖掘。李林等[11]從基因組水平對微藻的脂肪酸、淀粉進行分析，挖掘與其合成和降解途徑中的相關(guān)基因。Novaes E et al.[12]在巨桉的轉(zhuǎn)錄組研究當中發(fā)現(xiàn)了新基因的存在。王曉鋒等[13]采用Illumina高通量測序技術(shù)對轉(zhuǎn)錄組進行了測序，首次構(gòu)建了馬尾松均一化cDNA文庫，用生物信息學的方法對功能基因進行預測。

長白落葉松(Larixolgensis)是我國東北林區(qū)的主要速生造林樹種之一，生長速度快，材質(zhì)好，是工業(yè)用材和紙漿造紙的良好原料，對長白落葉松進行遺傳改良有著至關(guān)重要的作用。目前，在長白落葉松轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)方面的發(fā)表與研究比較匱乏，由于公共數(shù)據(jù)庫中公布的基因序列非常有限，所以材性優(yōu)異基因的挖掘與利用的研究較少。本研究通過對長白落葉松轉(zhuǎn)錄組測序,利用序列對比及功能注釋,發(fā)現(xiàn)可能參與材性基因合成相關(guān)酶的基因，為遺傳育種及資源挖掘提供重要信息。

1材料與方法

植物材料取自東北林業(yè)大學帽兒山實驗林場，根據(jù)長白落葉松生長物候期，分別于粗生長開始時期(5月5日)和粗生長旺盛期(6月15日)[14-16]取形成層及周圍組織薄層，立刻置于液氮中，放于冰箱-80 ℃保存。

RNA的提?。翰捎肅TAB法對上述時期采集的長白落葉松形成層分別進行總RNA提取，經(jīng)DNase I消化后，再等量分別混合。

1.1轉(zhuǎn)錄組測序

對于許多函數(shù)問題的求解往往需要應用多種知識和技能.因為高中的數(shù)學函數(shù)和許多復雜的知識是聯(lián)系在一起的，只有在頭腦中形成深刻的印象和學習思維，才能有條不紊地解決各種相關(guān)的例題，為高中數(shù)學函數(shù)的學習做出有效的應用探究.例如，和函數(shù)定義域相同的函數(shù)是( ).

用帶有Oligo(dT)的磁珠富集真核生物mRNA，加入Fragmentation Buffer將mRNA進行隨機打斷，以mRNA為模板，用六堿基隨機引物(random hexamers)合成第一條cDNA鏈，然后加入緩沖液、dNTPs、RNase H和DNA polymerase I合成第二條cDNA鏈，利用AMPure XP beads純化cDNA，純化的雙鏈cDNA再進行末端修復、加A尾并連接測序接頭，然后用AMPure XP beads進行片段大小選擇，最后通過PCR富集得到cDNA文庫。用HiSeq2500進行高通量測序，測序讀長為PE125。

1.2數(shù)據(jù)的組裝、注釋、功能分類和生物學通路分析

基于邊合成邊測序(Sequencing By Synthesis，SBS)技術(shù)，使用Illumina HiSeq2500高通量測序平臺對cDNA文庫進行測序，能夠產(chǎn)出大量的高質(zhì)量序列(Reads)，截除其中的測序接頭以及引物序列，過濾低質(zhì)量值數(shù)據(jù)，確保數(shù)據(jù)質(zhì)量。

使用Trinity[17]軟件從頭組裝轉(zhuǎn)錄組。將序列按照指定長度的核苷酸序列(K-mer)打斷來構(gòu)建數(shù)據(jù)庫，去除可能包含錯誤的序列。選擇頻率最高的作為種子向兩端進行貪婪延伸，不斷循環(huán)此過程直至耗光數(shù)據(jù)庫，從而得到重疊群(Contig)。再將其進行聚簇得到片段集合(Component)，對每個片段集合中的重疊群構(gòu)建De Bruijn圖。將De Bruijn圖進行簡化。以真實的測序序列來解開De Bruijn圖，獲得轉(zhuǎn)錄本序列。

使用BLAST[18]軟件將非重復基因序列(Unigene)與NR[19]、Swiss-Prot[20]、GO[21](Gene Ontology)、COG[22](Clusters of Orthologous Groups)、KEGG[20](Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)數(shù)據(jù)庫比對，獲得功能注釋和分類信息。最后與KEGG數(shù)據(jù)庫進行比對，分析得到相關(guān)的代謝通路。

2結(jié)果與分析

2.1長白落葉松轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)組裝結(jié)果

利用Trinity軟件進行組裝，組裝共得到19 279 388條重疊群(Contig)，總長度為836 941 382 bp。平均長度為43.41 bp，N50長度為45 bp。重疊群長度主要分布在≥200～300 bp，序列數(shù)量為19 211 854，占總量的99.65%。長度在≥300～500 bp的序列數(shù)量為32 682，占總量的0.17%；長度≥500 bp的序列數(shù)量為34 852，占總量的0.18%(表1)。

表1　重疊群組裝統(tǒng)計

表2　非重復序列基因組裝統(tǒng)計

2.2長白落葉松轉(zhuǎn)錄組功能注釋

2.2.1GO分類

為了進一步了解長白落葉松功能基因的情況，根據(jù)比對結(jié)果進行GO分類，有19 292個轉(zhuǎn)錄本注釋GO編號。對所獲得的非重復序列基因進行GO分類，歸納為3個類別，分別為細胞組分44 885個序列(表3)，分子功能21997個序列(表4)，生化過程(biological process)51 181個序列(表5)。3個類別又劃分為56個功能基因，有一些序列同時參與了多個調(diào)控過程。在細胞組分功能中，組成細胞、細胞和組成細胞器的明顯高于其他基因，而胞外區(qū)部分、細胞外基質(zhì)、細胞外基質(zhì)部分、病毒和部分病毒很少表達。在分子功能中,具有捆綁能力、催化功能的序列顯著高于其他基因，但營養(yǎng)儲藏活動、金屬活動、蛋白標簽和翻譯調(diào)節(jié)活性等基因幾乎未表達。在參與生物學進程的功能中，參與代謝過程、細胞形成過程的序列最多,分別占到總非重復序列的24.0%和21.4%，而轉(zhuǎn)移、病毒復制、碳利用率、細胞死亡和氮素利用率的序列則幾乎沒有表達。

表3　細胞組分中的功能基因

表4　分子功能中的功能基因

2.2.2COG分類

將所獲得的非重復序列基因在COG數(shù)據(jù)庫中比對，根據(jù)比對結(jié)果進行COG分析，有9112個轉(zhuǎn)錄本可以和數(shù)據(jù)庫比對上，并分為25個功能分類(見表6)，其中一般功能預測基因序列最多，共2 291條，占總注釋的25.1%。其次是復制、重組和修飾功能(1225條，占總注釋的13.44%)。而核結(jié)構(gòu)類注釋最少，僅為1條，細胞外結(jié)構(gòu)類注釋為0。

表5　生化過程中的功能基因

表6　轉(zhuǎn)錄組COG注釋功能分類

2.2.3KEGG注釋

為了明確長白落葉松活躍的生物代謝途徑，我們根據(jù)KEGG注釋結(jié)果，共獲得6 017個注釋序列，分別歸屬120條KEGG代謝通路，主要代謝途徑見(表7)。其中代謝途徑參與基因最多，為1 827個，占總注釋30.4%；其次是次生代謝產(chǎn)物合成途徑，參與基因為862個，占總注釋14.3%。數(shù)量排列前10名的代謝途徑占總共的72.4%。

表7　數(shù)量排列前10代謝途徑

2.3長白落葉松材性基因的挖掘

隨著第二代測序技術(shù)的快速發(fā)展，對針葉樹基因序列資源的挖掘受到了巨大的重視[24]。樹木的組分大部分都是次生木質(zhì)部，即木材。而纖維素和木質(zhì)素是木材次生木質(zhì)部的細胞壁重要組成成分。在材性性狀中，纖維素含量、木質(zhì)素含量等是主要考慮因素，尤其是纖維素含量直接影響制漿得率。

木質(zhì)素的生物合成是在一系列酶的催化作用下，通過苯丙烷途徑及木質(zhì)素合成特異途徑，將苯丙氨酸(或酪氨酸)轉(zhuǎn)化生成3種主要木質(zhì)素單體，最后聚合形成木質(zhì)素。在長白落葉松轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的注釋中找到木質(zhì)素相關(guān)非重復序列基因(Unigene)共68條，與木質(zhì)素合成相關(guān)酶29條，與木質(zhì)素分解代謝相關(guān)酶27條，其中包含咖啡酰輔酶A氧甲基轉(zhuǎn)移酶(CCoAOMT)6條、肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)4條、漆酶(Laccase)4條、苯丙氨酸氨基裂解酶(PAL)6條、4-香豆酸輔酶A連接酶(4CL)5條,肉桂醇脫氫酶(CAD)1條。這幾種酶是木質(zhì)素生物合成關(guān)鍵酶基因[25]。而在纖維素合成過程中，最重要的酶就是纖維素合酶，目前,對楊樹、桉樹等經(jīng)濟樹種研究比較深入，并已成功克隆出桉樹、楊樹多個纖維素合酶基因[26]。在網(wǎng)上公布的數(shù)據(jù)庫中，長白落葉松纖維素相關(guān)序列并未見報道。本研究轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中，根據(jù)轉(zhuǎn)錄本注釋，找到了147條纖維素相關(guān)基因，其中與纖維素合成相關(guān)基因103條，與纖維素分解代謝相關(guān)基因44條。

3結(jié)論與討論

目前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)廣泛應用于生物信息挖掘，所含基因信息豐富[27]。在對非模式生物的轉(zhuǎn)錄組研究中，國內(nèi)已開展了如丹參[28]，東北紅豆杉[29]、麻黃[30]等中藥植物轉(zhuǎn)錄組研究；如玉米[31]、黃瓜[32]等作物的轉(zhuǎn)錄組研究。在林木中，桉樹[33-34]，挪威云杉[35]、日本落葉松[36]、馬尾松[13]的轉(zhuǎn)錄組研究也已相繼開展。在丹參[28]轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中共獲得基因注釋的非重復序列基因(Unigene)13 308條，有4 927條未被注釋到。本研究中長白落葉松轉(zhuǎn)錄組已獲得基因注釋的Unigene為29 350條，是丹參的兩倍之多，而未被注釋的Unigene為28 333條，是丹參的5.75倍。麻黃轉(zhuǎn)錄組中Unigene長度分布大于2 000 bp序列所占比例為0.44%，在本研究中其所占比例為11.45%。這是由于針葉樹具有龐大而復雜的基因組，重復序列多，導致其與丹參、麻黃之間的巨大差異。而馬尾松[13]轉(zhuǎn)錄組測序得到的結(jié)果中，重疊群(contig)大于300 bp的數(shù)量為53 677條，大于1 kb的數(shù)量為17 386條；長白落葉松的contig數(shù)量分別為67 534、17 118條。在整個轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中分析，兩針葉樹種之間在大于300 bp的數(shù)量上稍有差異，在大于1 kb的數(shù)量上相差不大，表明針葉樹種雖具有巨大的基因組，但同為針葉樹，有可能在數(shù)量上相差不大。同時這一結(jié)果也表明，長白落葉松的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)在材性基因序列挖掘方面具有可觀的數(shù)量。

在林木基因工程育種過程中，提高其抗逆能力如抗干旱、抗?jié)?、抗鹽堿、抗凍、抗病蟲害是學者們主要的研究方向。雖然有些樹種控制木質(zhì)素與纖維素合成的基因已有報道，但材性改良方面的研究仍比較薄弱，長白落葉松作為我國東北林區(qū)的主要速生造林樹種之一，具有重要的經(jīng)濟與生態(tài)價值，其材性相關(guān)基因序列在已公布的數(shù)據(jù)庫中鮮有報道。截止至今，在長白落葉松基因序列挖掘研究中，本研究所發(fā)現(xiàn)的材性相關(guān)基因序列是現(xiàn)階段報道過最多的。長白落葉松木質(zhì)素和纖維素基因序列的成功挖掘，為進一步克隆其合成與代謝關(guān)鍵酶的基因全長、研究其具體功能提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

由于針葉樹基因組巨大，重復序列多，世代周期長，研究手段有限，在科研經(jīng)費預算中是一筆很大的花銷，所以針葉樹基因組學研究滯后于模式植物和作物。長白落葉松為非模式植物，數(shù)據(jù)庫中基因資源缺乏，可供參考的信息相對較少，導致本研究中僅有50.01%的Unigene能對應GO、COG、KEGG等數(shù)據(jù)庫中的注釋，有29 333條Unigene未被注釋到，這部分未被注釋的Unigenes很有可能是新基因。這些序列對后續(xù)開展長白落葉松的功能基因研究、生物合成途徑分析、分子標記、多態(tài)性分析具有重要價值。因此對其特異性的新基因的發(fā)掘還有待進一步的深入研究。

隨著針葉樹基因資源的不斷積累，轉(zhuǎn)錄組測序所得到的基因序列等數(shù)據(jù)有助于材性性狀在分子遺傳育種方向進行改良，也為與長白落葉松相近的物種在基因組學研究中提供了有價值的參考基因。

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收稿日期：2015年10月26日。

作者簡介：第一趙佳麗，女，1990年5月生，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，碩士研究生。E-mail:380543302@qq.com。通信作者:張含國，林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業(yè)大學)，教授。E-mail:hanguozhang1@sina.com。

1)國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)(2013AA102704)。

責任編輯：潘華。