楊秀芹，宋旭婷，徐　雪，陸明海，亓美玉，姚玉昌（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱　5000；.黑龍江農(nóng)墾科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，哈爾濱　504；.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱　50086）

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綿羊群體中不同布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法比較研究

楊秀芹1，宋旭婷1，徐雪1，陸明海2，亓美玉3，姚玉昌1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，哈爾濱150030；2.黑龍江農(nóng)墾科技職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)系，哈爾濱150431；3.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所，哈爾濱150086）

摘要：布魯氏菌?。˙rucellosis）是由布魯氏菌屬細(xì)菌（Brucella）引起的人畜共患傳染病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，造成重大經(jīng)濟(jì)損失和嚴(yán)重公共健康問(wèn)題。利用菌體細(xì)胞或光滑型脂多糖（S-LPS）作抗原，檢測(cè)待檢動(dòng)物血清中抗體血清學(xué)診斷方法，是布魯氏菌病檢疫主要手段。但目前尚無(wú)完美的單一檢測(cè)方法用于動(dòng)物布魯氏菌檢測(cè)。本研究針對(duì)RBT，SAT，iELISA和cELISA四種常用檢測(cè)方法，在綿羊群體中（n=204），利用敏感性、特異性、Youden指數(shù)、AUC值等參數(shù)評(píng)估其準(zhǔn)確性。應(yīng)用單一方法檢測(cè)時(shí)，iELISA敏感性最高（93.15%）；SAT特異性最高（98.47%）；iELISA的Youden指數(shù)和AUC值最大，分別達(dá)到88.75%和0.94。四種不同檢測(cè)方法中，iELISA和cELISA之間符合率最高（87.25%），SAT和iELISA之間Kappa值最高（0.72）。兩種方法組合作平行試驗(yàn)時(shí)，所有組合以SAT+iELISA的Youden指數(shù)值和AUC值最大，分別達(dá)到92.27%和0.96；系列試驗(yàn)時(shí)，RBT + iELISA的Youden指數(shù)值和AUC值最大，分別達(dá)到83.70%和0.92。研究結(jié)果將為布魯氏菌病凈化過(guò)程中檢測(cè)組合的篩選提供參考，從而提高診斷準(zhǔn)確性。

關(guān)鍵詞：布魯氏菌?。谎鍖W(xué)診斷；綿羊

楊秀芹,宋旭婷,徐雪,等.綿羊群體中不同布魯氏菌病血清學(xué)診斷方法比較研究[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2016,47(3):11-16.

Yang Xiuqin,Song Xuting,Xu Xue,et al.Comparision of different serological tests for diagnosis of Brucella infection in sheep[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):11-16.(in Chinese with English abstract)

布魯氏菌病（Brucellosis），簡(jiǎn)稱(chēng)布病，由布魯氏菌屬細(xì)菌（Brucella）（一種革蘭氏陰性、細(xì)胞內(nèi)寄生菌）致人畜共患的傳染病-變態(tài)反應(yīng)性疾病，在世界范圍內(nèi)廣泛分布，給畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類(lèi)健康帶來(lái)極大威脅[1]。Assenga研究表明動(dòng)物感染后呈急性或慢性癥狀，臨床主要表現(xiàn)母畜流產(chǎn)、乳腺炎、不育和各種組織（如睪丸、關(guān)節(jié)）炎癥[2]。Galińska指出接觸布魯氏菌感染的病畜或畜產(chǎn)品（主要來(lái)自羊、牛和豬）可使人類(lèi)患病，病期持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，需長(zhǎng)時(shí)間抗生素治療，嚴(yán)重可致殘，喪失勞動(dòng)能力[3]。Pappas研究表明該病在世界上160多個(gè)國(guó)家和地區(qū)流行，亞洲呈逐年上升趨勢(shì)[4]。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委疾病預(yù)防控制局統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，僅2014年，我國(guó)布魯氏菌病人發(fā)病數(shù)為57 222人，其中死亡2人，與2013年同期相比發(fā)病率增加31.48%。

動(dòng)物布魯氏菌病確診應(yīng)分離病原體、鑒定種和生物型，但分離過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)，且陽(yáng)性檢出率低[5]。同時(shí)，對(duì)生物安全防護(hù)措施等級(jí)和操作人員技術(shù)水平要求較高[6]。因此，布魯氏菌病檢疫最常用技術(shù)仍為血清學(xué)診斷方法，包括虎紅平板凝集試驗(yàn)（Rose bengal test，RBT）、試管凝集試驗(yàn)（Serum agglutination test，SAT）、間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Indirect enzyme-linked immunosorbent assays，iELISA）、競(jìng)爭(zhēng)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Competitive enzyme-linked immunosorbent assays，cELISA）、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)（Complement fixation test，CFT）、乳牛全乳環(huán)狀試驗(yàn)（Milk ring test，MRT）和熒光偏振試驗(yàn)（Fluorescence polarization assay，F(xiàn)PA）等。目前尚無(wú)單一血清學(xué)診斷方法同時(shí)兼顧高度的敏感性和特異性[7]，Minas等研究表明，RBT、CFT和cELISA敏感性只有75.80%、80.60%和76.50%[8]。ELISA和 FPA操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)快速、結(jié)果客觀，但成本較高，難以大規(guī)模推廣應(yīng)用[9]。目前，布魯氏菌病檢疫過(guò)程中常采用RBT和SAT檢測(cè)[10]，二者也是國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646-2002）中規(guī)定的常規(guī)檢測(cè)方法。因此，同時(shí)采用兩種或兩種以上新舊結(jié)合的診斷方法檢疫、凈化群體，可有效控制布魯氏菌病流行。

本研究采用RBT、SAT、iELISA和cELISA四種血清學(xué)診斷方法檢測(cè)綿羊布魯氏菌病，應(yīng)用系列和平行試驗(yàn)系統(tǒng)比對(duì)分析檢測(cè)結(jié)果，以期為布魯氏菌病檢疫檢測(cè)組合的篩選提供參考，提高診斷準(zhǔn)確性。

1　材料與方法

1.1臨床樣品及試劑

于存在疫情的東北細(xì)毛羊群體中選擇2～4歲個(gè)體204只，靜脈采集血液，分離血清后-80℃保存待用。布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清，RBT抗原購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所（批號(hào)201503）；SAT抗原購(gòu)自中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所（批號(hào)201505）；iELISA試劑盒和cELISA試劑盒購(gòu)自國(guó)內(nèi)廠家。

1.2 RBT檢測(cè)操作流程

按動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646-2002）。將30 μL陰、陽(yáng)及受檢血清滴加至檢測(cè)面板，取抗原30 μL，與血清混勻，出現(xiàn)凝集現(xiàn)象為陽(yáng)性，反之為陰性。

1.3 SAT檢測(cè)操作流程

準(zhǔn)備100 μL受檢血清、0.5%石炭酸的10%鹽溶液，按動(dòng)物布魯氏菌病診斷技術(shù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB/T 18646-2002），置于37～40℃溫箱24 h，若終濃度為1?25的血清稀釋度出現(xiàn)++以上凝集反應(yīng)為陽(yáng)性，反之為陰性。

1.4 iELISA檢測(cè)操作流程

將1?50倍稀釋的對(duì)照血清和受檢血清100 μL加入包被好的96孔酶標(biāo)板中，室溫孵育30 min；4次洗板后加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的IgG，室溫孵育30 min；4次洗板后加入含有一定量TMB和H2O2的底物溶液75 μL顯色10 min，再加入75 μL的1 mol·L-1H2SO4終止酶繼續(xù)反應(yīng)，測(cè)定OD450 nm計(jì)算陽(yáng)性百分比：陽(yáng)性百分比（P%）=受檢樣品OD值×100/強(qiáng)陽(yáng)性血清的平均OD值。

1.5 cELISA檢測(cè)操作流程

將1?10倍稀釋的對(duì)照血清和受檢血清50 μL加入包被好的96孔酶標(biāo)板中，在反應(yīng)的所有孔中加入單克隆抗體，室溫振動(dòng)孵育30 min；4次洗板后加入100 μL辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG，室溫孵育30 min；4次洗板后加入含有一定量TMB和H2O2的底物溶液75 μL振動(dòng)孵育顯色10 min，再加入75 μL的1 mol·L-1H2SO4終止酶繼續(xù)反應(yīng)，測(cè)定OD450 nm計(jì)算抑制百分比：抑制百分比（I%）=100-受檢樣品OD值×100/樣本稀釋液平均OD值。

1.6臨床樣品檢測(cè)與結(jié)果分析

對(duì)所有血清樣品采用RBT、SAT、iELISA和cELISA方法血清學(xué)檢測(cè)，至少兩種方法同時(shí)鑒定呈陽(yáng)性判定羊只患病，作為陽(yáng)性參照。計(jì)算各診斷方法的敏感性（Diagnostic sensitivity，DSn）、特異性（Diagnostic specificity，DSp）、Youden's J值、陽(yáng)性似然比（Positive likelihood ratio，+LR）、陰性似然比（Negative likelihood ratio，-LR）及曲線下面積（Area under curve，AUC）等。根據(jù)符合率和kappa分析評(píng)估不同檢測(cè)方法符合情況，利用McNemar方法評(píng)估各檢測(cè)方法間差異。利用SPSS 18.0軟件相關(guān)模塊作Receiver operator characteristics（ROC）曲線、kappa分析、McNemar分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同檢測(cè)方法的基本數(shù)據(jù)

利用RBT、SAT、iELISA和cELISA四種方法同時(shí)對(duì)204份血清樣品檢測(cè)，見(jiàn)表1。單種檢測(cè)方法中，在不考慮陽(yáng)性參照情況下，RBT檢出的陽(yáng)性率最高，接近40%，其次為iELISA檢驗(yàn)，SAT檢出的陽(yáng)性率最低。所有組合中，以RBT+iELISA組合檢出的陽(yáng)性率最高（29.90%）。在考慮陽(yáng)性參照情況下，即以至少兩種方法同時(shí)呈陽(yáng)性結(jié)果則判定羊只患病，得到實(shí)際發(fā)病率為35.78%（95%CI：29.29%～42.82%）。所有檢測(cè)樣品中，22.06%（45/ 204）的個(gè)體在四種檢測(cè)方法中均呈陽(yáng)性，49.02% （100/204）個(gè)體在四種檢測(cè)方法中均呈陰性。

表1　不同血清學(xué)檢測(cè)方法的陽(yáng)性、陰性結(jié)果Table 1 Number of sera with positive and negative results in different serological tests

2.2四種不同檢測(cè)方法的基本評(píng)價(jià)

四種檢測(cè)方法的敏感性、特異性、Youden指數(shù)及AUC值見(jiàn)表2，圖1。可知iELISA敏感性最高（93.15%）；SAT特異性最高（98.47%）。以iELISA 的Youden指數(shù)和AUC值最大，分別達(dá)88.75%和0.94。四種檢測(cè)方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性似然比、陰性似然比見(jiàn)表3。

2.3不同檢測(cè)方法之間符合情況

四種檢測(cè)方法之間符合情況見(jiàn)表4。以iELISA 和cELISA之間符合率最高（87.25%），RBT和cELISA之間符合率最低（79.90%）。Kappa值以SAT 和iELISA之間最高（0.72），RBT和iELISA間最低（0.57）。經(jīng)McNemar檢驗(yàn)，RBT和SAT間差異極顯著（P<0.01），SAT和iELISA間，SAT和cELISA間差異顯著（P<0.05），其他比較差異不顯著（P>0.05）。

2.4平行試驗(yàn)和系列試驗(yàn)下兩種不同檢測(cè)方法組合結(jié)果

平行試驗(yàn)和系列試驗(yàn)狀態(tài)下，不同檢測(cè)組合敏感性、特異性、Youden指數(shù)和AUC值見(jiàn)表5。由表5可知，進(jìn)行平行試驗(yàn)時(shí)，所有組合中以SAT+iELISA的Youden指數(shù)值和AUC值最大，分別達(dá)到92.27%和0.96；進(jìn)行系列試驗(yàn)時(shí)，所有組合中以RBT+iELISA的Youden指數(shù)值和AUC值最大，分別達(dá)到83.70%和0.92。所有組合中以SAT+iELISA平行試驗(yàn)時(shí)Youden指數(shù)值和AUC值最大。

表2　不同血清學(xué)檢測(cè)方法的敏感性、特異性、Youden指數(shù)及AUC值結(jié)果Table 2　 Results of diagnostic sensitivity,diagnostic specificity,Youden's J value and AUC for different serological tests

圖1　不同血清學(xué)檢測(cè)方法的ROC分析曲線Fig.1 ROC analysis curves for different serological tests

表3　不同血清學(xué)檢測(cè)方法的陽(yáng)性預(yù)測(cè)值、陰性預(yù)測(cè)值和陽(yáng)性似然比、陰性似然比結(jié)果Table 3　 Results of positive predictive value,negative predictive value，+LR,and -LR of different serological tests

表4　不同檢測(cè)方法之間符合情況比較Table 4　 Comparison of agreement of results for different serological tests

表5　平行試驗(yàn)和系列試驗(yàn)狀態(tài)下兩種不同血清學(xué)檢測(cè)方法組合結(jié)果Table 5 Results of parallel and serial combinations of two different serological tests

3　討論

動(dòng)物布魯氏菌病臨床診斷復(fù)雜，通過(guò)分離病原體確診患病羊檢出率低，對(duì)生物安全防護(hù)措施等級(jí)和操作人員技術(shù)水平要求較高，不適于生產(chǎn)中大規(guī)模監(jiān)測(cè)。目前，利用菌體細(xì)胞或光滑型脂多糖（S-LPS）作抗原，檢測(cè)待檢動(dòng)物血清中抗體的血清學(xué)診斷方法，為布魯氏菌病檢疫的主要手段。其中，RBT、SAT、iELISA和cELISA四種血清學(xué)診斷方法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，均為生產(chǎn)中常用的布魯氏菌病診斷方法。研究人員建立并優(yōu)化布魯氏菌病的檢測(cè)方法，Hari等優(yōu)化的牛種布魯氏菌病Super agglutination檢測(cè)方法，與RBT、ELISA以及CFT相比較特異性和敏感性均有提高，該種方法是一個(gè)感染簡(jiǎn)單，準(zhǔn)確和經(jīng)濟(jì)的篩選試驗(yàn)[11]；Ahmed等以小鼠為模型，建立B.melitensis rOMPs （rOMP25，rOMP28和rOMP31）iELISA方法，特異性和敏感性均可達(dá)到99%以上[12]。但目前血清學(xué)診斷技術(shù)均存在一定假陽(yáng)性率和假陰性率，因此同時(shí)采用兩種或兩種以上診斷方法檢疫和凈化尤為必要。

本研究在相同飼養(yǎng)條件、品種的隨機(jī)自然感染群體中，以至少兩種檢驗(yàn)方法同時(shí)鑒定為陽(yáng)性結(jié)果作患病羊只判定標(biāo)準(zhǔn)[13-14]，得到實(shí)際發(fā)病率為35.78%（95%置信區(qū)間：29.29%～42.82%）。

RBT方法敏感性和特異性均不高，Blasco也認(rèn)為其不適于臨床患病個(gè)體確診[15]。但RBT具有操作簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉等優(yōu)勢(shì)，仍可作為群體篩選的推薦方法，與其他技術(shù)方法結(jié)合使用。SAT方法主要針對(duì)血清中IgM抗體檢測(cè)敏感性最低，但特異性最高，Youden指數(shù)和AUC值最低。iELISA敏感性和特異性較好，Youden指數(shù)和AUC值最大，分別達(dá)到88.75%和0.94。cELISA的敏感性和特異性介于其他組之間。王淑云等比較5種檢測(cè)人布魯氏菌病的血清學(xué)方法（SAT、RBPT、PAT、ELISA和GICA法）特異性和敏感性，結(jié)果表明ELISA在診斷人布魯菌病中特異性和敏感性較高，分別達(dá)到86.0%和94.8%[16]。

不同檢測(cè)方法間，iELISA和cELISA一致性最好，符合率和Kappa值分別達(dá)到87.25%和0.72；RBT和cELISA一致性最差，符合率和Kappa值分別為79.90%和0.57。因此，各種檢測(cè)方法存在明顯檢測(cè)盲區(qū)，在檢疫、凈化過(guò)程使用兩種或兩種以上檢測(cè)方法交叉互補(bǔ)，既可減少因誤殺造成的經(jīng)濟(jì)損失，又可降低因漏檢造成布魯氏菌病流行風(fēng)險(xiǎn)。

本研究中，利用兩種檢測(cè)方法作平行試驗(yàn)（兩種診斷方法中任一種方法鑒定為陽(yáng)性時(shí)即判定為患病個(gè)體）時(shí)，所有組合的敏感性（DSn）均大于95%，RBT+iELISA的敏感性最高（99.34%）；綜合考慮特異性（DSp），SAT+iELISA組合的Youden指數(shù)和AUC值最大，分別達(dá)到92.27%和0.96。系列試驗(yàn)（兩種診斷方法同時(shí)鑒定為陽(yáng)性時(shí)則判定為患病個(gè)體）中，所有組合特異性均超過(guò)99%，其中SAT+ iELISA和SAT+cELISA組合特異性最好，綜合考慮敏感性，RBT+iELISA組合的Youden指數(shù)和AUC值最大，分別為83.70%和0.92。Minas等研究綿羊和山羊群體時(shí)表明，平行試驗(yàn)策略下敏感性均大于94%，系列試驗(yàn)策略下特異性均大于99%，顯著優(yōu)于單一檢測(cè)方法[8]。在非疫區(qū)或患病率很低的群體內(nèi)，目標(biāo)為常規(guī)監(jiān)測(cè)疫病流行情況時(shí)，可選用系列試驗(yàn)策略下特異性較好組合，如RBT+iELISA方式；而在疫區(qū)或患病率較高的群體內(nèi)，目標(biāo)為快速凈化群體時(shí)，應(yīng)選用平行試驗(yàn)策略下敏感性較好組合，如SAT+ iELISA方式[8]。

因此，針對(duì)于不同檢測(cè)目標(biāo)，適當(dāng)?shù)臋z測(cè)策略（平行試驗(yàn)或系列試驗(yàn)），可有效提高布魯氏菌病臨床診斷準(zhǔn)確性，對(duì)控制布魯氏菌病流行，減少畜牧業(yè)經(jīng)濟(jì)損失，降低人感染疫病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義。

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Comparision of different serological tests for diagnosis of Brucella infection in sheep

YANG Xiuqin1,SONG Xuting1,XU Xue1,LU Minghai2,QI Meiyu3,YAO Yuchang1(1.School of Animal Science and Technology,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China; 2.Department of Animal Science,Heilongjiang State Farm Science Technology Vocational College,Harbin 150431,China; 3.Institute of Animal Husbandry,Heilongjiang Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150086,China)

Abstract:Brucellosis,a bacterial disease caused by various types of Brucella spp.,cause economic loss and public health problem and had a worldwide distribution.The diagnosis of Brucella spp.infection in animals mainly depended on serological tests using bacterial cells or smooth lipopolysaccharide(S-LPS)as antigens to detect antibodies in serum.Until now,there has been no perfect individual test to diagnose Brucella spp.infection in animals.In a sheep group(n=204),the accuracies of RBT,SAT,iELISA and cELISA were assessed with DSn,DSp,Youden's J value,AUC values etc.According to single test,the highest DSn,93.15%,was observed using iELISA,and the highest DSp,book=12,ebook=1798.47%,was observed using SAT.The iELISA appears to showed a higher Youden's J value(88.75%)and AUC value(0.94)than the other tests.The highest agreement rate(87.25%)was observed between iELISA and cELISA,and the highest kappa value(0.72)were observed by between SAT and iELISA.When the existing tests were used in parallel for any combination,the highest Youden's J value(92.27%)and AUC value(0.96)was observed by using combinations of SAT with iELISA.When the tests were combined in serial,the highest Youden's J value(83.70%)and AUC value(0.92)was observed using combinations of RBT with iELISA.This study would help to select adaptive combination of different tests,and to improve identification and diagnosis of infected animals in brucellosis eradication programs.

Key words:Brucellosis; serological tests; sheep

作者簡(jiǎn)介：楊秀芹（1971-），女，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)閯?dòng)物抗病育種。E-mail:xiuqin163@163.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專(zhuān)項(xiàng)課題（2014ZX08008- 005）

收稿日期：2015-12-19

中圖分類(lèi)號(hào)：S852.614；R446.61

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1005-9369（2016）03-0011-06