李廣興，李沛然，李鵬沖，任玉東，黃小丹，張瑞莉，吳　憲（.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱　50030；.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電氣與信息學(xué)院，哈爾濱　50030）

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2006～2012年豬繁殖與呼吸綜合征病毒東北毒株GP5和M基因變異分析

李廣興1，李沛然1，李鵬沖1，任玉東2，黃小丹1，張瑞莉1，吳憲1
（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，哈爾濱150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)電氣與信息學(xué)院，哈爾濱150030）

摘要：分離鑒定三株中國東北地區(qū)PRRSV，對其主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5和M基因RT-PCR擴(kuò)增和測序，同時對2006～2012年東北地區(qū)PRRSV毒株進(jìn)行遺傳變異分析。結(jié)果表明，三株東北地區(qū)PRRSV分離株均屬于美洲型高致病性毒株，JilinTN2株和HH12株可能由JXA1變異而來，GP5基因變異較大，而M基因相對保守；一些氨基酸變異會改變GP5和M蛋白的二級結(jié)構(gòu)；GP5蛋白中和表位Q(40)和L(41)的突變和誘騙表位L(28)的新突變在2011和2012年黑龍江省PRRSV毒株中被發(fā)現(xiàn)，33～37 aa處氨基酸的變異對潛在糖基化位點的數(shù)量和位置影響較大，可能會干擾中和抗體對緊隨其后的中和表位識別，減少病毒中和抗體應(yīng)答；GP5中PRRSV毒力關(guān)鍵位點的新突變在2012年分離株中被發(fā)現(xiàn)。文章揭示東北地區(qū)PRRSV流行毒株GP5基因的變異特征，PRRSV仍在不斷發(fā)生變異，需針對GP5基因變異采取相應(yīng)防控措施。

關(guān)鍵詞：豬繁殖與呼吸綜合征病毒；GP5；M；基因變異；分子進(jìn)化

李廣興,李沛然,李鵬沖,等.2006～2012年豬繁殖與呼吸綜合征病毒東北毒株GP5和M基因變異分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2016,47(3):1-10.

Li Guangxing,Li Peiran,Li Pengchong,et al.Genetic variation analysis of GP5 and Mgene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in Northeastern China 2006-2012[J].Journal of Northeast Agricultural University,2016,47(3):1-10.(in Chinese with English abstract)

豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS）是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV）引起的以妊娠母豬繁殖障礙及仔豬呼吸道癥狀、敗血癥及高死亡率為特征的高度接觸性傳染病[1]。自PRRS首次在美國[2]和歐洲[3]發(fā)現(xiàn)并流行，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)嚴(yán)重傳染病之一。郭寶清等在我國首次分離到PRRSV[4]，每年都有PRRS疫情出現(xiàn)。2006年由PRRSV變異株引起的高熱病給中國養(yǎng)豬業(yè)帶來嚴(yán)重?fù)p失[5]，先后有25個以上省市有本病發(fā)生和流行，超過5 000萬頭豬被感染，并有2 000萬頭死亡[6]。2011～ 2012年河南和山西的部分豬場也出現(xiàn)PRRSV感染[7]，表明PRRSV可逃避機(jī)體免疫使豬群長期帶毒并持續(xù)感染。PRRSV重要特點是基因組高變異性[8]。GP5是PRRSV病毒粒子中變異最大的結(jié)構(gòu)蛋白，廣泛用于PRRSV遺傳進(jìn)化分析[9-10]。GP5蛋白與M蛋白通過二硫鍵以異源二聚體形式存在，能夠與唾液酸黏附素N端結(jié)合，以病毒形式感染細(xì)胞[11]。通過GP5和M分析可更全面反映PRRSV變異情況。

本研究從我國東北地區(qū)（下簡稱東北地區(qū)）疑似PRRS病例中分離得到三株P(guān)RRSV（JilinTN1株、JilinTN2株和HH12株），克隆和測序其主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5和M基因，并上傳至NCBI GenBank。根據(jù)三株分離株基因相似性分析結(jié)果及其在中國代表PRRSV毒株遺傳進(jìn)化樹中位置，明確三株分離株基因型和進(jìn)化地位。收集并整理NCBI GenBank中已公布的東北地區(qū)PRRSV毒株共53株（包括本文分離三株），進(jìn)行遺傳進(jìn)化和GP5關(guān)鍵功能區(qū)氨基酸變異分析，預(yù)測變異株生物學(xué)特性，對了解當(dāng)前東北地區(qū)PRRSV變異現(xiàn)況、明確PRRSV主要流行毒株以及PRRS防治具有重要意義。

1　材料與方法

1.1材料

Marc-145細(xì)胞，E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞均為東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院動物病理學(xué)教研室提供；TRIzol Reagent（購自Invitrogen公司）；pMD18-T載體，其他酶，PCR試劑等（購自Takara公司）；FITC-羊抗兔-IgG（購自中杉金橋生物公司）；膠回收試劑盒，質(zhì)粒提取試劑盒（索萊寶公司）。

1.2 PRRSV分離與鑒定

將3份疑似感染PRRSV發(fā)病豬病料（2份來自2011年吉林省、1份來自2012年黑龍江?。┖蜏缇鶳BS按照1?5比例研磨后反復(fù)凍融3次，經(jīng)濾膜過濾后將濾液與雙抗于4℃作用過夜后于單層Marc-145細(xì)胞上盲傳。待細(xì)胞出現(xiàn)明顯細(xì)胞病變后，應(yīng)用間接免疫熒光檢測，其中一抗為1?100倍稀釋的抗PRRSV多克隆抗體，二抗為1?200倍稀釋的FITC-羊抗兔-IgG。

1.3分離株GP5及M基因克隆和序列測定

利用TRIzol Reagent提取病毒總RNA，M-MLV酶反轉(zhuǎn)錄。根據(jù)NCBI GenBank發(fā)表的PRRSV GP5 及M序列信息，利用軟件Oligo6.0設(shè)計同時擴(kuò)增GP5和M基因全長引物。引物序列為GP5MF（5' GAGGTGGGCAACTGTTTTAG 3'）和GP5MR（5' TTC TGCTGCTTGCCGTTGTT 3'）。應(yīng)用Ex Taq進(jìn)行GP5 和M基因擴(kuò)增，PCR反應(yīng)條件為：95℃5 min，94℃1 min，55.9℃1 min，72℃2 min，共30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后與pMD18-T載體金屬浴連接12 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞中，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR及雙酶切鑒定，篩選出陽性重組子送金唯智公司測序。

1.4分離株相似性分析及GP5-M遺傳進(jìn)化樹構(gòu)建

應(yīng)用BLAST和Lasergene1（DNASTAR Inc.，Madison，WI）軟件對三株P(guān)RRSV分離株GP5-M測序結(jié)果作基因相似性分析。選取NCBI GenBank上已公布的中國、美國和荷蘭代表毒株共54株（見表1）應(yīng)用軟件MEGA 5.2中Neighbor-joining（NJ）方法構(gòu)建GP5-M基因遺傳進(jìn)化樹。所有毒株GP5及M基因僅保留編碼區(qū)進(jìn)行拼接，核苷酸替代模型為Kimura2-parameter，bootstrap值為1 000。

表1　本研究所用PRRSV毒株Table 1 PRRSV strains used in the study

續(xù)表

1.5分離株二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

登陸http://npsa-pbil.ibcp.fr，應(yīng)用在線工具預(yù)測三株分離株GP5蛋白及M蛋白二級結(jié)構(gòu)。

1.6東北地區(qū)PRRSV毒株遺傳進(jìn)化分析和GP5關(guān)鍵功能區(qū)氨基酸變異分析

整理NCBI GenBank上所有東北地區(qū)PRRSV毒株GP5氨基酸序列（見表1），應(yīng)用軟件MEGA 5.2 中NJ方法和Jones- Taylor- Thornton（JTT）模型，構(gòu)建GP5氨基酸遺傳進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)為1 000。結(jié)合進(jìn)化樹結(jié)果分析GP5氨基酸序列關(guān)鍵功能區(qū)變異情況。

2　結(jié)果與分析

2.1 PRRSV分離與鑒定結(jié)果

三株P(guān)RRSV在marc-145細(xì)胞上盲傳數(shù)代后細(xì)胞出現(xiàn)典型CPE，表現(xiàn)為細(xì)胞聚堆、圓縮、甚至脫落，呈局灶性變化，病變細(xì)胞折光性發(fā)生改變；IFA顯示在細(xì)胞病變處出現(xiàn)特異性熒光（見圖1）。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果（見圖2）顯示，三株分離株經(jīng)RT-PCR均能擴(kuò)增出與預(yù)期片段長度相符的特異性條帶（約1 192 bp）。

2.2陽性克隆鑒定及測序結(jié)果

所選陽性克隆經(jīng)PCR及雙酶切鑒定均出現(xiàn)預(yù)期長度片段。登陸NCBI網(wǎng)站，應(yīng)用BLAST進(jìn)行陽性重組質(zhì)粒測序結(jié)果分析，結(jié)果表明擴(kuò)增得到序列為PRRSV GP5及M基因。將2株吉林分離株命名為JilinTN1和JilinTN2，黑龍江分離株命名為HH12，測序得到的6個基因序列上傳至NCBI GenBank，登陸號分別為JN157760、JN157761、JN157763、JN157764、KF741693和KF741694。

2.3 PRRSV分離株基因序列相似性分析及遺傳變異分析結(jié)果

三株P(guān)RRSV分離株的GP5基因和M基因序列與中國首個分離的高致病性分離株JXA1、美洲型經(jīng)典株VR-2332、中國經(jīng)典疫苗株CH-1a、美洲型疫苗株RespPRRS MLV、中國分離經(jīng)典型代表毒株HB-2（sh）2002及歐洲型代表毒株Lelystad virus的GP5和M基因相似性分析結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，PRRSV GP5蛋白存在變異，而M蛋白相對保守。與美洲型標(biāo)準(zhǔn)株VR-2332比對，JilinTN1、JilinTN2及HH12分離株GP5氨基酸序列分別出現(xiàn)22、25及24處氨基酸突變；與中國高致病性分離株JXA1比對，分別發(fā)現(xiàn)2、3及2處突變，三株分離株均未發(fā)現(xiàn)氨基酸插入和缺失。SOPMA法表明某些氨基酸變異會使GP5和M蛋白二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變（見圖3）。

由GP5-M遺傳進(jìn)化樹（見圖4）可知，所選的參考毒株可分為歐洲型（代表株Lelystad virus）和美洲型。美洲型可分為3個亞群：以VR-2332及Resp PRRS MLV為代表的亞群I，以HB-2分析sh2002及ch-1a為代表的亞群2，以JXA1為代表的亞群3。三株分離株屬于亞群3，故為美洲型高致病性毒株。JilinTN1株與2010年分離來自福建省的10-10-FUJ1株和廣西省的10-10-GX1株親緣關(guān)系最近且處于同一分支，JilinTN2株和HH12株與2006年爆發(fā)的HP-PRRS代表株JXA1親緣關(guān)系較近，且基因相似性超過99%，因此這兩個毒株的祖先可能是JXA1。

圖1　PRRSV HH12株在Marc-145細(xì)胞上形態(tài)學(xué)觀察和IFA檢測結(jié)果Fig.1 Propagation and IFA result of PRRSV HH12 isolate on Marc-145 cells

圖2　RT-PCR擴(kuò)增GP5及M基因Fig.2 RT-PCR amplification of GP5 and M gene

表2　三株分離株與PRRSV參考毒株GP5和M基因的相似性比較Table 2 Percentage of GP5 and M nucleotide identity of 3 PRRSV isolates compared with PRRSV reference strains

圖3　GP5和M蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Fig.3 Prediction of GP5 and M protein’s secondary structure

圖4　GP5-M基因遺傳進(jìn)化樹Fig.4 Phylogenetic trees of GP5-M genes

2.4東北地區(qū)PRRSV遺傳進(jìn)化分析

NCBI GenBank中整理中國東北地區(qū)所有PRRSV分離株（見表1）共53株。由GP5氨基酸遺傳進(jìn)化樹可知東北地區(qū)PRRSV分離株均為美洲型毒株，分為4個亞群（見圖5）：分別是以VR-2332 和HH08株為代表的亞群1，以JMS01和HLJHB01為代表的亞群2，以QQHE02株和HLJHL株為代表的亞群3及以HG08株與JLYS株為代表的亞群4。遼寧LN0701株和LN1101株分別形成兩個單獨分支。亞群4中毒株數(shù)量明顯高于其他3個亞群，說明亞群4毒株為東北地區(qū)主要流行株，本文分離的JilinTN2和HH12株也屬于此亞群。

2.5東北地區(qū)PRRSV GP5關(guān)鍵功能區(qū)氨基酸序列變異分析結(jié)果

GP5蛋白包含1個信號肽區(qū)和3個跨膜區(qū)。與標(biāo)準(zhǔn)毒株VR-2332相比，東北地區(qū)PRRSV毒株中有49株在信號肽片段處發(fā)現(xiàn)5處一致突變。即東北地區(qū)PRRSV毒株亞群3（下簡稱亞群3）中2009年分離株L15全部突變?yōu)镻15，2012年分離株JMS04株、MDJ02株和JMS05株的L14突變?yōu)镾14，而這3個毒株在第3個跨膜區(qū)的V124突變?yōu)锳124。GP5蛋白存在中和表位（37～45 aa，primary neutralizing epitope，PNE）[12]，在病毒中和活性起關(guān)鍵作用，與VR-2332相比，除HH08株外其他52株的L39均突變?yōu)镮39，而HH08株的H38L39突變?yōu)镼38F39。PNE處的Q40和L41新突變只在2012年和2011年黑龍江省毒株中發(fā)現(xiàn)（HG07株和HLJQ02株L41→S41，HLJMS01株、HLJDX02株和HLJEB02株Q40L41→E40S41，HLJQ01 株Q40→E40）。在PNE附近，存在一個誘騙表位（A27/V27LVN）[12]，誘騙表位能阻止多數(shù)抗GP5抗體，延遲病毒中和抗體產(chǎn)生。除HLJDQ01株外，亞群3毒株均在誘騙表位處出現(xiàn)氨基酸突變（V29→A29）；而除HLJDX02株外，亞群4的其他毒株在這一位置均未出現(xiàn)突變。L28的突變在HLJMS01株、HLJQ01株、HLJQ02株、HLJDQ04株（L28→H28）中發(fā)現(xiàn)，新突變毒株與PNE處發(fā)現(xiàn)新突變（Q40和L41）的毒株基本一致。分離株潛在糖基化位點（N-X-S/ T）的位置和數(shù)量對GP5功能有較大影響[13]，53株P(guān)RRSV在44 aa和51 aa處均存在2個保守潛在糖基化位點，3亞群和4亞群的所有毒株在30 aa處存在一個保守潛在糖基化位點，而33～37 aa處氨基酸的變異對潛在糖基化位點數(shù)量和位置影響較大，不同毒株可存在1～3個潛在糖基化位點。JilinTN2株和HH12株在196 aa處發(fā)現(xiàn)一處與其他分離株明顯不同的B細(xì)胞表位突變（Q196→R196）。對GP5免疫顯性T細(xì)胞表位分析（117～131、149～163 aa）：與VR-2332比對，50株分離株在第121位、第127位和第161位處出現(xiàn)相同的突變（T121→I121、F127→L127和I161→V161），而JMS04株、MDJ02株和JMS05株在第124位的V124突變?yōu)锳124。有研究證明13及151 aa處的氨基酸突變（R13→Q13，R151→G151）與PRRSV的減毒作用有關(guān)[14-15]，在JMS04株（R13→Q13）中發(fā)現(xiàn)這一突變，而在HLJDQ01株（R13→G13）、HLJDX01株和LN1101株（R151→K151）則出現(xiàn)新突變，這4個毒株均為2012年分離株，新的突變對PRRSV毒力影響尚需進(jìn)一步研究。另外用于區(qū)分疫苗株的A137[16]在53株分離株中均未發(fā)現(xiàn)，這些毒株可能均為自然變異的野毒株。

3　討論與結(jié)論

我國東北地區(qū)部分豬場出現(xiàn)PRRSV感染，但東北地區(qū)PRRSV流行及基因變異情況尚無相關(guān)研究。PRRS難以控制的重要原因之一是PRRSV基因組高變異性[8]，特別是與病毒抗原性相關(guān)的GP5蛋白在PRRSV結(jié)構(gòu)蛋白中變異率最大[17]。由于GP5暴露在囊膜表面，能誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，在抗體選擇的壓力下，更易發(fā)生變異。

本研究從2011～2012年東北地區(qū)分離并鑒定三株美洲型HP-PRRSV分離株，發(fā)現(xiàn)三株病毒株GP5變異率較高，而M相對保守，與前人報道相同[18]。經(jīng)BLAST、基因相似性分析和二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析，三株病毒株不同于其他任何毒株。自然環(huán)境中機(jī)體與病毒作用、疫苗選擇壓力等因素可能引發(fā)抗原變異。

GP5蛋白有N端的信號肽片段、1個外側(cè)區(qū)、3個跨膜區(qū)和1個內(nèi)側(cè)區(qū)。在53株東北地區(qū)PRRSV GP5氨基酸序列中發(fā)現(xiàn)2處高變區(qū)（24～39和185～ 200 aa），其中24～39 aa這一高變區(qū)包括部分信號肽片段及PNE。GP5 PNE突變可能會影響病毒的中和活性及逃避疫苗誘導(dǎo)的中和抗體能力，GP5的誘騙表位在引起抗GP5抗體的產(chǎn)生及延遲中和抗體產(chǎn)生有重要作用，研究表明其延遲效應(yīng)可達(dá)到3周以上[12-14]。對GP5的PNE和誘騙表位分析，在2011和2012年的黑龍江PRRSV分離株發(fā)現(xiàn)新突變（如Q40L41→E40S41和L28→H28）。GP5中有數(shù)量不定的潛在N-糖基化位點[19]，糖基化位點與病毒的入侵密切相關(guān)。研究證明將44位和51位的N突變后，病毒將失去感染細(xì)胞能力[14]。東北地區(qū)PRRSV毒株在30、44和51 aa處存在3個比較保守的糖基化位點。33～37 aa處氨基酸變異對潛在糖基化位點數(shù)量和位置影響較大，由于空間位阻作用，此處糖基化位點的變化很有可能干擾中和抗體對緊隨其后的PNE識別，減少病毒中和抗體的應(yīng)答，使PRRSV逃避機(jī)體免疫保護(hù)。在2012的分離株中，本文發(fā)現(xiàn)，與PRRSV的毒力相關(guān)的關(guān)鍵位點發(fā)生新突變（HLJDQ01 株R13→G13，HLJDX01株和LN1101株R151→K151）[19]，而新突變對PRRSV毒力的影響需進(jìn)一步研究。

本試驗結(jié)果表明，東北地區(qū)PRRSV流行毒株為美洲型高致病毒株，其GP5基因變異廣泛存在，隨時間變化出現(xiàn)新變異，GP5變異將直接降低PRRS疫苗株交叉保護(hù)率，因此篩選合適的疫苗株及PRRS預(yù)警和防控是今后研究重點。針對GP5氨基酸關(guān)鍵功能區(qū)新突變毒株展開深入研究，可為新疫苗開發(fā)提供思路。

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Genetic variation analysis of GP5 and M gene of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in Northeastern China 2006-2012

LI Guangxing1,LI Peiran1,LI Pengchong1,REN Yudong2,HUANG Xiaodan1,ZHANG Ruili1,WU Xian1(1.School of Veterinary Medicine,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China;2.School of Electrical and Information,Northeast Agricultural University,Harbin 150030,China)

Abstract:GP5 and M gene of 3 porcine reproductive and respiratory syndrome virus(PRRSV)isolates from Northeastern China were amplified,sequenced and compared with PRRSV isolates during 2006-2012 in Northeastern China published in NCBI GenBank.The results showed that three PRRSV isolates belonged to the high pathologic North American type,and JilinTN2 and HH12 might evolve from JXA1 strain.Mgene was highly conserved considering of GP5 gene.The predictive secondary structure of GP5 and M might be changed with certain amino acid mutations.Some new mutations(L(28),Q(40)andbook=2,ebook=7L(41))of GP5 were found in its primary neutralizing epitope(PNE)and decoy peptide of PRRSV strains isolated from Heilongjiang Province in 2011 and 2012.Mutations in amino acid sequence from 33 to 37 exerted tremendous effect on the numbers and positions of GP5 potential N-glycosylation sites,and it might interfere the recognition of PNE by neutralizing antibody.Regarding of PRRSV virulence key sites in GP5 gene,novel mutations were also found in PRRSV isolates of 2012.This paper elucidated the molecular variation of GP5 gene of PRRSV strains isolated from Northeastern China and highlighted the importance of continuous surveillance for PRRSV.

Key words:PRRSV; GP5; M; genetic variation; molecular evolution

作者簡介：李廣興（1968-），男，教授，博士，博士生導(dǎo)師，研究方向為動物病理學(xué)。E-mail:ligx@neau.edu.cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目（31200122,31270187）；教育部博士點基金項目（20122325110019）；黑龍江省普通高等學(xué)校長江學(xué)者后備支持計劃項目（2013CJHB002）

收稿日期：2015-02-07

中圖分類號：S852.65

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1005-9369（2016）03-0001-10