310005浙江省杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科九病區(qū)

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·論著·

雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及其網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

【摘要】目的評(píng)價(jià)雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用，并研究其作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)。方法2014年12月—2015年7月選取SPF級(jí)健康Wistar大鼠40只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組，每組10只。采用熱殺死結(jié)核分枝桿菌誘導(dǎo)大鼠構(gòu)建類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后，雙氯芬酸組大鼠給予10 mg/kg雙氯芬酸灌胃,雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠給予6 mg/kg雷公藤內(nèi)酯醇灌胃,對(duì)照組和模型組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定大鼠血清中炎性細(xì)胞因子〔腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-4、IL-6〕表達(dá)水平；評(píng)價(jià)關(guān)節(jié)炎指數(shù)及足體積；利用Chemidraw 2010軟件將雷公藤內(nèi)酯醇轉(zhuǎn)換成3D形式,預(yù)測(cè)其可能的作用靶點(diǎn)；利用Cytoscape軟件通過BLAST數(shù)據(jù)庫和美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能注釋和分類，得到雷公藤內(nèi)酯醇的網(wǎng)絡(luò)藥理圖。結(jié)果模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平較對(duì)照組升高(P<0.05)；雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)；雙氯芬酸組與雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第4、8、12、16、20天雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)較模型組降低(P<0.05)；雙氯芬酸組與雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠足體積較對(duì)照組增大(P<0.05)；第4、6、8、10、12、14、16、20天雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠足體積較模型組減小，第18天雙氯芬酸組大鼠足體積較模型組減小(P<0.05)；第2、4、6、8、10、12、14、16、20天雙氯芬酸組與雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠足體積比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第18天雙氯芬酸組大鼠足體積較雷公藤內(nèi)酯醇組減小(P<0.05)。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究示，6個(gè)靶點(diǎn)(MP2K1、ADH5、BACE1、ADK、GLO1、AKR1B1)存在基因-靶點(diǎn)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)，9條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與免疫和炎癥相關(guān)，包括focal adhesion、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、toll-like receptor、ErbB、促性腺激素釋放激素(GnRH)、NK cell-mediated cytotoxicity、Fc epsilon RI 和B cell receptor信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。結(jié)論雷公藤內(nèi)酯醇治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠可降低TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足體積，其治療作用主要是通過調(diào)節(jié)MAPK和VEGF等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路實(shí)現(xiàn)。

310005浙江省杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科九病區(qū)

【關(guān)鍵詞】關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；雷公藤內(nèi)酯；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；腫瘤壞死因子α；白介素4；白介素6

胡偉鋒，王昌興.雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用及其網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(12)：1408-1413.[www.chinagp.net]

Hu WF,Wang CX.Therapeutic effect and network pharmacology of triptolide for rheumatoid arthritis in rats[J].Chinese General Practice，2016，19(12)：1408-1413.

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種臨床多發(fā)的自身免疫性疾病，以關(guān)節(jié)及關(guān)節(jié)周圍組織慢性炎癥為主要表現(xiàn)[1]。其臨床癥狀具有反復(fù)性，一般病程較長、預(yù)后差、治療效果不明顯、致殘率高，嚴(yán)重危害患者健康[2]。近年來，在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病機(jī)制及病理變化等研究領(lǐng)域取得了長足的進(jìn)步，但是患者需要長期服用非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素等西藥治療，不良反應(yīng)較大[3]。中藥治療具有與西藥治療效果相似、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)，因此近年來越來越引起醫(yī)藥界的關(guān)注[4]。對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效最為突出的中藥首推雷公藤，其可以祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛、消腫止痛、解毒殺蟲，用于濕熱結(jié)節(jié)、癌瘤積毒等病癥的治療，臨床上用其治療麻風(fēng)反應(yīng)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等，有抗腫瘤、抗炎等作用。其中的環(huán)氧二萜內(nèi)酯化合物-雷公藤內(nèi)酯醇，被廣泛認(rèn)為是最主要的抗炎和免疫抑制成分[5]。臨床試驗(yàn)表明，雷公藤內(nèi)酯醇具有抗氧化、抗風(fēng)濕、抗癌等功效，為常用的抗風(fēng)濕藥物，能顯著緩解類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎癥狀[6]，然而，關(guān)于其治療機(jī)制的研究仍處于起始階段，詳細(xì)作用機(jī)制仍需深入研究。本研究構(gòu)建大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，并對(duì)大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型以及雷公藤內(nèi)酯醇的治療作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后利用藥效物質(zhì)來虛擬篩選靶點(diǎn)，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路，在基因、靶點(diǎn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路層面上研究雷公藤內(nèi)酯醇作用的分子機(jī)制，明確其抗風(fēng)濕的治療效果，為其臨床治療提供候選靶點(diǎn)，有助于臨床療效的判定及新藥研發(fā)。

本研究背景和創(chuàng)新點(diǎn)：

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一種臨床多發(fā)的自身免疫性疾病，病程長，長期服用非甾體類抗炎藥和糖皮質(zhì)激素的治療效果不理想。中藥提取物-雷公藤內(nèi)酯醇具有顯著的抗風(fēng)濕作用，但其作用機(jī)制一直未明。本研究利用熱殺死結(jié)核分枝桿菌構(gòu)建大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，并對(duì)大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型以及雷公藤內(nèi)酯醇的治療作用進(jìn)行評(píng)價(jià)，然后利用反向?qū)觼硖摂M篩選靶點(diǎn)，并結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路，在基因、靶點(diǎn)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路層面上研究雷公藤內(nèi)酯醇作用的分子機(jī)制，明確其抗風(fēng)濕作用的靶點(diǎn)為絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，有助于新藥的研發(fā)。

1材料與方法

1.1藥品與試劑熱殺死結(jié)核分枝桿菌(heat killed mycobacteriumtubercuolsis)購自 Difco實(shí)驗(yàn)室(Detroit，MI，USA)；雷公藤內(nèi)酯醇、雙氯芬酸購自中國藥品生物制品鑒定所；二甲基亞砜(DMSO)購自阿法埃莎(中國)化學(xué)有限公司；大鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白介素(IL)-4、IL-6酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)試劑盒購自瑞士Roche 公司。

1.2主要儀器Milli-Q超純水儀購自美國Millipore 公司；酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad 公司。

1.3試劑制備取熱殺死結(jié)核分枝桿菌5 mg，粉碎后置于1 ml甘油中，研磨使其混勻用于動(dòng)物給藥。另取雙氯芬酸、雷公藤內(nèi)酯醇適量分別溶于少量DMSO中，然后用超純水分別稀釋至1 mg/ml、2 mg/ml，超聲分散均勻后用于動(dòng)物給藥。

1.4動(dòng)物2014年12月—2015年7月選取SPF級(jí)健康Wistar大鼠40只，雄性；體質(zhì)量170～200 g，平均體質(zhì)量180 g；購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京) 2009-0012。飼養(yǎng)于23～26 ℃的標(biāo)準(zhǔn)動(dòng)物房中，飼養(yǎng)用具均進(jìn)行高壓滅菌和紫外除菌處理，每 12 h自動(dòng)熄燈，給予自由飲水和飲食。

1.5大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的建立[6]大鼠采用10%水合氯醛麻醉后，仰臥位固定到手術(shù)臺(tái)上，將頭部及四肢固定。采用75%乙醇溶液對(duì)尾根部消毒，然后在尾根部皮下注射0.2 ml熱殺死結(jié)核分枝桿菌(5 mg/ml)，然后立即用消毒棉球壓住注射部位，防止液體溢出。1 min后，松開固定繩，放于籠中讓其自然蘇醒。

1.6大鼠分組及給藥采用隨機(jī)數(shù)字表法分為4組，分別為對(duì)照組、模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組，每組10只。模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠建立類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，造模成功后，雙氯芬酸組大鼠給予10 mg/kg雙氯芬酸灌胃，1次/d，共3周；雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠給予6 mg/kg雷公藤內(nèi)酯醇灌胃，1次/d，共3周；對(duì)照組和模型組大鼠給予等量0.9%氯化鈉溶液灌胃，1次/d，共3周。

1.7血清炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平測(cè)定[7]灌胃3周后，取大鼠眼底靜脈叢血漿1 ml，4 ℃ 10 000 r/min離心10 min(離心半徑為10 cm)，取上清液。應(yīng)用大鼠TNF-α、IL-4、IL-6 ELISA法檢測(cè)試劑盒，將標(biāo)準(zhǔn)品用稀釋液作倍比稀釋，酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長處吸光度(OD值)。以標(biāo)準(zhǔn)品濃度的對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)、測(cè)定的OD值為縱坐標(biāo)做出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算血清TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平。

1.8類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的評(píng)價(jià)全身病變按5級(jí)評(píng)分法評(píng)價(jià)，根據(jù)四肢的病變程度累積計(jì)分，計(jì)算出關(guān)節(jié)炎指數(shù)。標(biāo)準(zhǔn)如下：0分，無紅腫；1分，小趾關(guān)節(jié)輕度紅腫；2分，小趾關(guān)節(jié)和足跖腫脹；3分，踝關(guān)節(jié)以下的趾甲腫脹；4分，包括踝關(guān)節(jié)在內(nèi)的全部趾甲、關(guān)節(jié)腫脹[8]。每4 d評(píng)價(jià)1次。采用足趾容積測(cè)量儀測(cè)量大鼠的足體積，每2 d測(cè)量1次。共觀察20 d。評(píng)估大鼠病情嚴(yán)重程度及藥物的治療作用。

名詞解釋：

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)的理論，對(duì)生物系統(tǒng)的網(wǎng)絡(luò)分析，選取特定信號(hào)節(jié)點(diǎn)(Nodes)進(jìn)行多靶點(diǎn)藥物分子設(shè)計(jì)的新學(xué)科。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)強(qiáng)調(diào)對(duì)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的多途徑調(diào)節(jié)，提高藥物的治療效果，降低不良反應(yīng)，從而提高新藥臨床試驗(yàn)的成功率，節(jié)省藥物的研發(fā)費(fèi)用。

1.10雷公藤內(nèi)酯醇靶點(diǎn)預(yù)測(cè)利用Chemidraw2010軟件將雷公藤內(nèi)酯醇轉(zhuǎn)換成3D形式(見圖1)，然后導(dǎo)入到藥效團(tuán)靶標(biāo)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反向?qū)樱A(yù)測(cè)其可能的作用靶點(diǎn)。

圖1　雷公藤內(nèi)酯醇3D結(jié)構(gòu)圖

1.11雷公藤內(nèi)酯醇網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究利用Cytoscape軟件，對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇、靶點(diǎn)蛋白與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行一一對(duì)應(yīng)，然后通過BLAST(TheBasicLocalAlignmentSearchTool)數(shù)據(jù)庫和美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行蛋白質(zhì)的功能注釋和分類，得到雷公藤內(nèi)酯醇的網(wǎng)絡(luò)藥理圖[7]。

2結(jié)果

2.1大鼠血清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較4組大鼠血清中炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平較模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙氯芬酸組與雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

2.2大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較皮下注射熱殺死結(jié)核分枝桿菌后，大鼠的關(guān)節(jié)逐漸出現(xiàn)腫脹，組織浸潤，顏色發(fā)紅，透明度提高。隨著時(shí)間的延長，踝關(guān)節(jié)部位開始出現(xiàn)硬化，足體積增大。第4、8、12、16、20天模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)較模型組降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；雙氯芬酸組與雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

2.3大鼠足體積比較第0天4組大鼠足體積比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天4組大鼠足體積比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中第2、4、6、8、10、12、14、16、18、20天模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠足體積較對(duì)照組增大，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第4、6、8、10、12、14、16、20天雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠足體積較模型組減小，第18天雙氯芬酸組大鼠足體積較模型組減小，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；第2、4、6、8、10、12、14、16、20天雙氯芬酸組與雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠足體積比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；第18天雙氯芬酸組大鼠足體積較雷公藤內(nèi)酯醇組減小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見表3)。

Table1Comparisonofexpressionlevelsofinflammatorycytokinesinserumamongthe4groups

組別只數(shù)TNF-αIL-4IL-6對(duì)照組1031.22±1.8728.13±1.0645.38±2.69模型組10517.35±36.76a735.51±41.63a496.21±25.41a雙氯芬酸組10286.36±42.56ab389.47±97.36ab235.14±41.66ab雷公藤內(nèi)酯醇組10312.28±28.97ab425.27±26.79ab289.76±45.22abF值264.58357.26268.34P值<0.001<0.001<0.001

注：TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-4=白介素4，IL-6=白介素6；與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

表2　3組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)比較±s)

注：與模型組比較，aP<0.01

表3　4組大鼠足體積比較

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與雙氯芬酸組比較，cP<0.05

2.4雷公藤內(nèi)酯醇靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇進(jìn)行虛擬的靶點(diǎn)和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路預(yù)測(cè)，通過PharmMapper數(shù)據(jù)庫，共預(yù)測(cè)出99個(gè)靶點(diǎn)，選擇得分較高的10個(gè)靶點(diǎn)再通過KEGG反向?qū)?，其?個(gè)靶點(diǎn)(MP2K1、ADH5、BACE1、ADK、GLO1、AKR1B1)存在基因-靶點(diǎn)-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路網(wǎng)絡(luò)(見圖2)。在6個(gè)靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)的44條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，9條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路與免疫和炎癥相關(guān)，包括focal adhesion、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、toll-like receptor、ErbB、促性腺激素釋放激素(GnRH)、NK cell-mediated cytotoxicity、Fc epsilon RI 和B cell receptor信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

3討論

本研究通過構(gòu)建大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型，證實(shí)了雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效，并對(duì)其治療的機(jī)制進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，研究結(jié)果表明，模型組、雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平、足體積較對(duì)照組升高；雙氯芬酸組、雷公藤內(nèi)酯醇組大鼠血清中TNF-α、IL-4、IL-6表達(dá)水平、關(guān)節(jié)炎指數(shù)、足體積較模型組降低，證明了模型組造模成功，雷公藤內(nèi)酯醇對(duì)于類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有顯著療效，與臨床常用的雙氯芬酸較為接近。本研究提示，雷公藤內(nèi)酯醇治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎是一個(gè)非常復(fù)雜的藥理網(wǎng)絡(luò)體系，包含9條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。在這9條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中，有7條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路現(xiàn)在未見其與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的報(bào)道，因此本研究不再進(jìn)行討論，但其是今后藥理學(xué)研究的重點(diǎn)。另外有2條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，分別為與炎癥和膠原形成相關(guān)，是抗風(fēng)濕活性化合物起效的必要通路，在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展中均起著非常重要的調(diào)節(jié)作用[9]。本研究所發(fā)現(xiàn)的這2條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路很好地詮釋了雷公藤內(nèi)酯醇的抗炎作用，彌補(bǔ)了以前的動(dòng)物和細(xì)胞層面的藥理學(xué)研究的不足。

既往研究結(jié)果表明，類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎形成過程中JAK-STAT、蛋白酪氨酸激酶(PTKs)、MAPK、VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路均被激活，其中MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還包括了細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、p38、JNK 3條重要的與關(guān)節(jié)炎癥相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[10]。雷公藤內(nèi)酯醇能夠下調(diào)ERK1/2和p38磷酸化，抑制ERK和p38 MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路；同樣，還可以顯著抑制TNF-α刺激引起的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)的表達(dá)，并且減少一氧化氮(NO)和前列腺素E2(PGE2)的生成，而且抑制作用與濃度呈正相關(guān)[11]。另外，VEGF是參與調(diào)控血管發(fā)生和血管新生的關(guān)鍵分子，幾乎參與了類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病全過程[12-13]。因此，本研究從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)角度對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇的抗風(fēng)濕藥理作用的闡釋，可以進(jìn)一步闡明其作用機(jī)制為通過調(diào)節(jié)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來抑制炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)VEGF信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在關(guān)節(jié)抑制細(xì)胞因子的表達(dá)，來減少膠原蛋白的產(chǎn)生、抑制滑膜細(xì)胞增殖、減弱侵襲能力等。二者相互配合，從兩個(gè)方面起到對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠的治療作用。

圖2　雷公藤內(nèi)酯醇的網(wǎng)絡(luò)藥理圖

近些年來，國內(nèi)外研究人員對(duì)雷公藤內(nèi)酯醇做了大量研究，提示雷公藤內(nèi)酯醇具有較為顯著的抗炎作用，尤其是對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎有非常好的功效，能顯著減輕骨關(guān)節(jié)疼痛、恢復(fù)關(guān)節(jié)功能、改善關(guān)節(jié)部位的組織液滲出性[11,14]。然而，未見從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)層面研究雷公藤內(nèi)酯醇抗風(fēng)濕作用的相關(guān)報(bào)道。

本研究證實(shí)，雷公藤內(nèi)酯醇可以通過藥理學(xué)網(wǎng)絡(luò)，對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠起到顯著的治療作用，為臨床指導(dǎo)用藥提供了理論依據(jù)。但是，大鼠類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型的構(gòu)建和評(píng)價(jià)還較為主觀，缺乏與實(shí)際患者貼切的客觀實(shí)驗(yàn)依據(jù)，后續(xù)的研究中應(yīng)該在模型建立和評(píng)價(jià)方面進(jìn)一步展開。

作者貢獻(xiàn)：胡偉鋒進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文；王昌興進(jìn)行質(zhì)量控制及審校,并對(duì)文章負(fù)責(zé)。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Therapeutic Effect and Network Pharmacology of Triptolide for Rheumatoid Arthritis in Rats

HUWei-feng,WANGChang-xing.TheNinthWard,DepartmentofOrthopedics,theSecondAffiliatedHospitalofZhejiangChineseMedicineUniversity,Hangzhou310005,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the therapeutic effect of triptolide on rheumatoid arthritis(RA) in rats,and study its network pharmacology.MethodsFrom December 2014 to July 2015,we selected 40 healthy Wistar rats of SPF grade and randomly divided them into 4 groups,which were control group,model group,diclofenac group,triptolide group,with 10 rats in each group.Heat-killed mycobacterium tuberculosis was used to induce RA models of rats.After model building,the rats of diclofenac group were given 10 mg/kg diclofenac by gavage;the rats of triptolide group were given 6 mg/kg triptolide by gavage;the rats of control group and model group were given the same amount of 0.9% sodium chloride solution by gavage.By enzyme linked immunosorbent assay,the expression levels of inflammatory cytokines in serum〔tumor necrosis factor alpha(TNF-α) and interleukin(IL)-4,IL-6〕 were determined;evaluated the arthritis index and feet volume;Chemidraw 2010 software was employed to convert triptolide into 3D form and predict its possible target proteins and pathways;Cytoscape software was employed to make annotation and classification of protein function by BLAST database and NCBI database,and the network pharmacology of triptolide was obtained.ResultsModel group,diclofenac group and triptolide group were higher than control group in the expression of TNF-α,IL-4 and IL-6(P<0.05);diclofenac group and triptolide group were lower than model group in the expression of TNF-α,IL-4 and IL-6(P<0.05);diclofenac group and triptolide group were not significantly different in the expression of TNF-α,IL-4 and IL-6(P<0.05).Diclofenac group and triptolide group were lower than model group in arthritis index on day 4,day 8,day 12,day 16 and day 20(P<0.05),and diclofenac group and triptolide group were not significantly different in arthritis index(P>0.05).Model group,diclofenac group and triptolide group were larger than control group in feet volume on day 2,day 4,day 6,day 8,day 10,day 12,day 14,day 16,day 18 and day 20(P<0.05);diclofenac group and triptolide group were smaller than model group in feet volume on day 4,day 6,day 8,day 10,day 12,day 14,day 16 and day 20,and were smaller than model group in feet volume on day 18(P<0.05);diclofenac group and triptolide group were not significantly different in feet volume on day 2,day 4,day 6,day 8,day 10,day 12,day 14,day 16 and day 20(P>0.05);diclofenac group was smaller than triptolide group in feet volume on day 18(P<0.05).The study of network pharmacology of triptolide showed that gene-target-signal transduction network existed among 6 targets(MP2K1,ADH5,BACE1,ADK,GLO1 and AKR1B1),and 9 signal transduction pathways were related with immunity and inflammation,including focal adhesion,MAPK,VEGF,toll-like receptor,ErbB,GnRH,NK cell-mediated cytotoxicity,Fc epsilon RI and B cell receptor.ConclusionTriptolide for treatment of rheumatoid arthritis can decrease the expression levels of TNF-α,IL-4 and IL-6,arthritis index and feet volume.Its therapeutic effect is mainly realized by regulating signal transduction pathways of MAPK and VEGF.

【Key words】Arthritis,rheumatoid；Triptolide；Network pharmacology；Tumor necrosis factor-alpha；Interleukin-4；Interleukin-6

(收稿日期：2015-10-20；修回日期：2016-02-24)

【中圖分類號(hào)】R 593.22

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.011

通信作者：王昌興，310005浙江省杭州市，浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨科九病區(qū)；E-mail:hwfhwf6768@163.com

基金項(xiàng)目：浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LY14H060005)

胡偉鋒，王昌興