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·論著·

復(fù)方中藥對(duì)鏈球菌性肺炎小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子的影響研究

【摘要】目的探討復(fù)方中藥對(duì)鏈球菌性肺炎小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子白介素(IL)-6、IL-2、干擾素γ(INF-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)、IL-10表達(dá)水平的影響。方法2014年3—10月選取健康BALB/c小鼠36只，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組：正常組、鏈球菌性肺炎模型組(模型組)、復(fù)方中藥治療組(中藥組)，每組12只。模型組、中藥組小鼠分別破損鼻黏膜，滴入50 μl配好的肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株溶液；正常組小鼠破損鼻黏膜，滴入50 μl無菌0.9%氯化鈉溶液。中藥組小鼠給予7.5 g·kg(-1)·d(-1)復(fù)方中藥灌胃，正常組和模型組小鼠給予等劑量雙蒸水灌胃，均2次/d，連續(xù)給藥7 d。給藥第7天，取肺組織，觀察病理學(xué)表現(xiàn)，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)各組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平。結(jié)果蘇木素-伊紅(HE)染色光鏡下顯示，正常組肺泡結(jié)構(gòu)及上皮完整，肺泡腔清晰，肺泡內(nèi)無滲出物，肺泡間隔均勻一致，無增厚，毛細(xì)血管無明顯擴(kuò)張、充血及炎性細(xì)胞浸潤；模型組肺泡腔內(nèi)充滿滲出的纖維素，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚及毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血；中藥組肺泡腔內(nèi)纖維素滲出較少，肺間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤，少量紅細(xì)胞，部分肺泡破壞融合，與模型組比較有所減輕。模型組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平較正常組升高(P<0.05)；中藥組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平較模型組降低(P<0.05)；中藥組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論復(fù)方中藥能有效抑制鏈球菌性肺炎小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10的過度表達(dá)，緩解炎性反應(yīng)。

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【關(guān)鍵詞】肺炎球菌感染；復(fù)方合劑；小鼠；白介素類；干擾素γ；腫瘤壞死因子α

張麗娜，叢培瑋，李鄉(xiāng)南.復(fù)方中藥對(duì)鏈球菌性肺炎小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子的影響研究[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(12)：1467-1471.[www.chinagp.net]

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肺炎鏈球菌是5歲以下兒童社區(qū)獲得性肺炎最常見的致病菌，30%～50%的小兒細(xì)菌性肺炎由肺炎鏈球菌所致[1]。肺炎鏈球菌耐藥情況比較嚴(yán)重，特別是對(duì)阿奇霉素、紅霉素、氯林可霉素、四環(huán)素及復(fù)方磺胺甲噁唑片等耐藥率較高，部分可高達(dá)95%以上[2-4]，如此高的耐藥率，可能與抗菌藥物的濫用有關(guān)，故大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類以及復(fù)方新諾明等抗菌藥物已不能作為治療鏈球菌性肺炎的有效藥物。中醫(yī)藥在防治鏈球菌性肺炎中起著積極的作用。本研究擬建立鏈球菌性肺炎小鼠模型，觀察復(fù)方中藥對(duì)鏈球菌性肺炎小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子白介素(IL)-6、IL-2、干擾素γ(INF-γ)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)及IL-10表達(dá)水平的影響，為復(fù)方中藥在鏈球菌性肺炎的臨床治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物2014年3—10月選取健康BALB/c小鼠36只，SPF級(jí)，雌雄各半，5～6周齡，體質(zhì)量18～20 g，由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2菌株肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株(CMCC 31203)購于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，經(jīng)血平板培養(yǎng)18 h后用無菌0.9%氯化鈉溶液稀釋至6×108CFU/ml(2麥?zhǔn)蠁挝?待用。

1.3藥物復(fù)方中藥組成：金銀花30 g、連翹30 g、玄參15 g、牛蒡子30 g、板蘭根15 g、黃芩30 g(購于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院)，以上6味藥加水浸泡1 h，然后煎煮3次，30 min/次，過濾合并濾液，濃縮至1 g/ml生藥量，置4 ℃冰箱保存，給藥前復(fù)溫25～30 ℃。

1.4試劑烏來糖(購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，藥品批號(hào)：20050922)，小鼠IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法檢測(cè)試劑盒(購于蘇州卡爾文生物科技有限公司)。

1.5儀器酶標(biāo)儀(Anthos 2010，奧地利安圖公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)(Anthos fluido，奧地利安圖公司)，離心機(jī)(TGL-16G，上海醫(yī)用分析儀器廠)，電動(dòng)勻漿機(jī)(FSH-2，江蘇省金壇市環(huán)宇科學(xué)儀器廠)，移液器(TriptteTM)，電熱恒溫箱(HH.B11.600，上海博迅醫(yī)療器械廠)，電子天平(JY5002，上海精密科學(xué)儀器有限公司)，顯微鏡(Olympus CX21，日本奧林巴斯公司)，石蠟切片機(jī)(徠卡2135，德國Leica公司)。

1.6實(shí)驗(yàn)分組將36只BALB/c小鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法(先雌雄分組，再按照隨機(jī)數(shù)字表法分組)分為3組：正常組、鏈球菌性肺炎模型組(模型組)、復(fù)方中藥治療組(中藥組)，每組12只，雌雄各半。3組小鼠周齡、體質(zhì)量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表1)。

表1　3組小鼠周齡、體質(zhì)量比較±s)

1.7鏈球菌性肺炎模型建立[5]每組小鼠稱重后，后腿肌肉注射10%烏來糖800 mg/kg進(jìn)行麻醉后，模型組、中藥組小鼠分別破損鼻黏膜，滴入50 μl配好的肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)菌株溶液(菌量3×107CFU)；正常組小鼠破損鼻黏膜，滴入50 μl無菌0.9%氯化鈉溶液。滴入同時(shí)注意觀察小鼠的呼吸情況，若出現(xiàn)窒息立即給予牽拉前肢、擠壓心臟處理。

1.8給藥每組給藥劑量根據(jù)小鼠體質(zhì)量按成人日劑量折算出等效劑量為2.5 g·kg-1·d-1。肺炎鏈球菌感染后1 h，中藥組小鼠按等效劑量的3倍給予7.5 g·kg-1·d-1復(fù)方中藥灌胃，2次/d，連續(xù)給藥7 d；正常組和模型組小鼠給予等劑量雙蒸水灌胃，2次/d，連續(xù)給藥7 d。

1.9觀察指標(biāo)檢測(cè)給藥第7天，每組采用隨機(jī)數(shù)字表法抽取10只小鼠，后腿肌肉注射10%烏來糖800 mg/kg麻醉后，固定于解剖板。75%乙醇消毒后，剖開胸腔，取出左肺，立即放入10%甲醛溶液中固定72 h，梯度乙醇溶液脫水后常規(guī)石蠟包埋，切片(厚度5 μm)，蘇木素-伊紅(HE)染色后鏡下觀察肺組織病理變化。取出右肺并稱重，加入9倍肺組織重的0.9%氯化鈉溶液，用電動(dòng)勻漿機(jī)勻漿，將肺勻漿于4 ℃下，12 000 r/min離心15 min(離心半徑6 cm)，收集上清液，儲(chǔ)存于-70 ℃冰箱，然后按照ELISA法測(cè)檢試劑盒說明書檢測(cè)肺組織炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α及IL-10表達(dá)水平。

2結(jié)果

2.1大體觀察正常組：雙肺呈均勻粉白色，表面光滑，組織有彈性，未見明顯水腫及出血點(diǎn)。模型組：雙肺出現(xiàn)廣泛大片狀的充血，肺組織外觀腫脹，暗紅色與淡黃色交織，彈性差。中藥組：雙肺可見小片狀的充血，彈性較差，色暗紅，與模型組小鼠比較，病變程度明顯減輕，肺臟暗褐色區(qū)域減少，肺組織充血、水腫減輕，實(shí)變區(qū)減少。

2.2HE染色光鏡觀察正常組：肺泡結(jié)構(gòu)及上皮完整，肺泡腔清晰，肺泡內(nèi)無滲出物，肺泡間隔均勻一致，無增厚，毛細(xì)血管無明顯擴(kuò)張、充血及炎性細(xì)胞浸潤(見圖1，本文圖1～3彩圖見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。模型組：肺泡腔內(nèi)充滿滲出的纖維素，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚及毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血(見圖2)。中藥組：肺泡腔內(nèi)纖維素滲出較少，肺間質(zhì)有少量炎性細(xì)胞浸潤，少量紅細(xì)胞，部分肺泡破壞融合，與模型組比較有所減輕(見圖3)。

圖1　正常組小鼠肺組織切片(HE染色，×200)

圖2　模型組小鼠肺組織切片(HE染色，×200)

圖3　中藥組小鼠肺組織切片(HE染色，×200)

2.3肺組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較3組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；其中模型組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平較對(duì)照組升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平較模型組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；中藥組小鼠肺組織IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平與正常組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，見表2)。

3討論

肺炎鏈球菌感染后機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)被破壞，免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)功能下降，若感染控制不當(dāng)可引起機(jī)體病理損傷甚至宿主死亡[6]。本研究肺組織切片顯示，鏈球菌性肺炎小鼠肺泡腔內(nèi)充滿滲出的纖維素，出現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚及毛細(xì)血管擴(kuò)張、充血等一系列病理損傷；而復(fù)方中藥能有效改善小鼠肺泡腔內(nèi)炎性滲出及黏膜損傷。劉琪等[7]研究表明，中藥(金銀花、連翹、牛蒡子等)能改善流感病毒感染小鼠肺組織引起的病理損傷。

研究顯示，IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10等炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平與鏈球菌性肺炎具有相關(guān)性[8-10]。在巨噬細(xì)胞釋放的炎性細(xì)胞因子中，IL-6、TNF-α等為早期主要的促炎性細(xì)胞因子[11]，促炎性細(xì)胞因子水平升高同時(shí)伴隨抗炎性細(xì)胞因子IL-10水平升高，IL-10具有很強(qiáng)的抗炎能力和免疫抑制活性，可下調(diào)多種促炎性細(xì)胞因子如TNF-α和INF-γ的表達(dá)，在多種疾病中發(fā)揮重要作用[12]。姜小麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，小鼠在感染肺炎鏈球菌后肺組織中INF-γ、TNF-α、IL-6、IL-10表達(dá)水平明顯升高，肺組織結(jié)構(gòu)恢復(fù)后抗炎性細(xì)胞因子IL-10表達(dá)水平才下降，提示IL-10在抑制肺炎鏈球菌感染所致的過強(qiáng)炎性反應(yīng)中有重要作用。本研究結(jié)果顯示，小鼠感染肺炎鏈球菌后，肺組織中各炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平明顯升高，與姜小麗等[8]研究IL-6、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平升高結(jié)果一致?？梢姡仔约?xì)胞因子承接固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答反應(yīng)，促炎性細(xì)胞因子及抗炎性細(xì)胞因子均在清除肺炎鏈球菌中發(fā)揮重要作用，維持其動(dòng)態(tài)平衡既能清除細(xì)菌也能避免過度炎性反應(yīng)所致的組織損傷[8]。IL-2是由活化的T細(xì)胞產(chǎn)生的具有廣泛生物活性的炎性細(xì)胞因子，參與炎癥或自身免疫性反應(yīng)，而且具有雙向免疫調(diào)節(jié)作用，是最受關(guān)注和被廣泛研究的細(xì)胞因子之一[13]。李繼庭等[14]研究表明，流感病毒感染小鼠血清中IL-2表達(dá)水平升高；王巍[10]研究表明，支原體肺炎大鼠肺組織IL-2表達(dá)水平降低；Koh等[15]研究發(fā)現(xiàn)，肺炎鏈球菌感染者支氣管肺泡灌洗液IL-2表達(dá)水平升高；劉賀臨等[16]研究表明，支原體肺炎患兒血清IL-2表達(dá)水平降低。本研究結(jié)果顯示，小鼠感染肺炎鏈球菌后肺組織IL-2表達(dá)水平升高，其機(jī)制可能是T細(xì)胞受刺激后產(chǎn)生IL-2，產(chǎn)生的IL-2又反作用于T細(xì)胞自身，誘導(dǎo)T細(xì)胞自身增殖、分化和發(fā)揮免疫功能[14]，與其他研究中不同動(dòng)物、組織及病原感染情況下研究結(jié)果各異[10,15-16]，其機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

表2　3組小鼠肺組織炎性細(xì)胞因子表達(dá)水平比較±s，pg/ml)

注：IL-6=白介素6，IL-2=白介素2，INF-γ=干擾素γ，TNF-α=腫瘤壞死因子α，IL-10=白介素10；與正常組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05

本研究復(fù)方中藥為臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有清熱解毒，化瘀通絡(luò)的功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，金銀花、連翹、黃芩、板藍(lán)根對(duì)肺炎鏈球菌具有較強(qiáng)的抑制作用[17-18]，玄參具有解熱、鎮(zhèn)痛、抗炎等作用[19]，牛蒡子具有抗炎、抗病毒、抗菌等作用[20]。金銀花能夠抑制人類肺臟細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α[21]。板藍(lán)根多糖可顯著抑制內(nèi)毒素誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌IL-6的活性[22]。黃芩苷體內(nèi)給藥一般可以減輕組織炎性損傷，下調(diào)模型動(dòng)物血漿促炎細(xì)胞因子表達(dá)水平(TNF-α、IL-6等)，并可以調(diào)節(jié)部分免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子[23]。本研究肺組織切片提示，中藥組炎性反應(yīng)較模型組明顯減輕，表明復(fù)方中藥對(duì)肺炎鏈球菌所致肺部炎性損傷有改善作用；炎性細(xì)胞因子比較結(jié)果顯示，中藥組炎性細(xì)胞因子IL-6、IL-2、INF-γ、TNF-α、IL-10表達(dá)水平較模型組明顯降低，表明復(fù)方中藥對(duì)以上炎性細(xì)胞因子具有調(diào)節(jié)作用，能有效抑制其過度分泌，緩解炎性反應(yīng)。

同時(shí)，本研究存在不足之處。首先，本研究未能揭示出復(fù)方中藥的最佳劑量及最佳用藥時(shí)機(jī)；其次，本研究實(shí)驗(yàn)時(shí)間較短，樣本量偏小，今后若能開展針對(duì)療效機(jī)制、大樣本、不同劑量的基礎(chǔ)研究可望得到更有說服力的結(jié)果。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，復(fù)方中藥對(duì)鏈球菌性肺炎小鼠炎性細(xì)胞因子具有拮抗作用。在鏈球菌性肺炎耐藥率升高的情況下，此研究為中醫(yī)藥防治鏈球菌性肺炎提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，具有良好的臨床開發(fā)前景，但其具體調(diào)節(jié)及作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)：張麗娜、叢培瑋進(jìn)行實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與實(shí)施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對(duì)文章負(fù)責(zé)；叢培瑋、李鄉(xiāng)南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)實(shí)施、評(píng)估、資料收集；叢培瑋進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：陳素芳)

Effects of Complex Prescription of Traditional Chinese Medicine on Inflammatory Cytokines in Lung Tissue of Streptococcus Pneumonia Mice

ZHANGLi-na,CONGPei-wei,LIXiang-nan.CentreforExperimentalTeaching，LiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine，Shenyang110847,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of complex prescription of traditional Chinese medicine on expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α,and IL-10 in lung tissue of streptococcus pneumonia mice.MethodsFrom March to October in 2014,we selected 36 healthy BALB/c mice and used random number table method to divide them into 3 groups,namely control group,streptococcus pneumonia model group(model group),and the group of complex prescription of TCM (TCM group),with 12 mice in each group.The mice in the model group and TCM group were given 50 μl standard solution of streptococcus pneumoniae through damaged nasal mucosa,and the mice in control group were given the same mount of 0.9% sodium chloride liquid.Mice in TCM group was given complex prescription of TCM by gavage by 7.5 g·kg(-1)·d(-1),and control group and model group were given the same amount of double distilled water by 2 times per day for 7 days consecutively.Lung tissues were taken in the 7 dany to observe pathological manifestations,and ELISA method was used to detect the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue.ResultsAfter the observation by HE staining and light microscope,we found the following results.In control group,the alveolar structure and epithelium were complete with clear alveolar space and no transudation;the alveolar space was homogeneous without incrassation;no obvious expansion,congestion and inflammatory cell infiltration occurred in inner capillaries.In model group,alveolar space was full of cellulose exudate;plenty of inflammatory cell infiltration occurred;alveolar space had incrassation;expansion and congestion occurred in capillaries.In TCM group,there was little cellulose exudate in alveolar space,little inflammatory cell infiltration in pulmonary mesenchyme and a small number of red blood cells;a part of pulmonary alveolis were damaged and merged;the condition was much relieved compared with model group.Model group was higher than control group in the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue(P<0.05).TCM group was lower than model group in the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue(P<0.05);TCM group was not significantly different from control group in the expression levels of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α and IL-10 in lung tissue(P>0.05).ConclusionComplex prescription of TCM can effectively inhibit the excessive secretion of IL-6,IL-2,INF-γ,TNF-α,and IL-10 in lung tissue of streptococcus pneumonia mice,and relieve inflammatory reaction.

【Key words】Pneumococcal infections；Drug combinations；Mice；Interleukins；Interferon-gamma；Tumor necrosis factor-alpha

(收稿日期：2015-07-24；修回日期：2016-02-16)

【中圖分類號(hào)】R 563.1

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.12.022

通信作者:叢培瑋，110847遼寧省沈陽市，遼寧中醫(yī)藥大學(xué)教學(xué)實(shí)驗(yàn)中心；E-mail:cpwshq2011@163.com

基金項(xiàng)目:遼寧省科學(xué)技術(shù)廳博士科研啟動(dòng)基金項(xiàng)目(20131069)

·中醫(yī)·中西醫(yī)結(jié)合研究·

張麗娜，叢培瑋，李鄉(xiāng)南