孫得勝，歐陽瑤，顧延會

563003貴州省遵義市，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科(孫得勝，歐陽瑤，顧延會)；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(孫得勝)

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·論著·

樹突細(xì)胞及其相關(guān)趨化因子受體在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表達(dá)變化及其意義

孫得勝，歐陽瑤，顧延會

563003貴州省遵義市，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科(孫得勝，歐陽瑤，顧延會)；華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科(孫得勝)

【摘要】目的 了解樹突細(xì)胞(DC)及其趨化因子受體CCR6、CCR7在慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺部的表達(dá)變化，并探討其意義。方法選用20只清潔級健康Wistar大鼠，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為健康對照組(10只)和COPD組(10只)。COPD組使用香煙煙霧刺激和氣道內(nèi)注入脂多糖(LPS)的方法制備COPD模型。第29天取大鼠肺組織，制作病理切片，行HE染色觀察其病理學(xué)改變；采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測肺部DC的表達(dá)水平，酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法檢測支氣管肺泡灌洗液(BALF)中CCR6和CCR7的表達(dá)水平。結(jié)果COPD組大鼠肺組織HE染色符合COPD典型病理表現(xiàn)，OX(62)和CD(83)的陽性染色均主要表達(dá)于細(xì)胞的胞質(zhì)，呈棕黃色。COPD組DC表達(dá)水平高于健康對照組，DC表達(dá)水平低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。COPD組BALF中CCR6表達(dá)水平高于健康對照組，CCR7表達(dá)水平低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。結(jié)論DC及其趨化因子受體CCR6在COPD大鼠肺部增多，而成熟DC及其趨化因子受體CCR7在COPD大鼠肺部減少。

【關(guān)鍵詞】肺疾病，慢性阻塞性；樹突細(xì)胞；受體，CCR6；受體，CCR7

孫得勝，歐陽瑤，顧延會.樹突細(xì)胞及其相關(guān)趨化因子受體在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表達(dá)變化及其意義[J].中國全科醫(yī)學(xué)，2016，19(11)：1301-1304.[www.chinagp.net]

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慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，氣道和肺組織對有害氣體或顆粒的異常炎性反應(yīng)是其重要特征[1]。這種炎癥的產(chǎn)生機(jī)制尚不明確，但有學(xué)者發(fā)現(xiàn)在COPD的發(fā)病過程中有免疫細(xì)胞被募集到肺[2]。COPD的免疫應(yīng)答是在特定的抗原驅(qū)使下完成的[2-3]，同時其受到樹突細(xì)胞(dendritic cell，DC)的嚴(yán)密調(diào)控[4-5]。DC環(huán)繞氣道形成敏感的防御體系，在外來抗原侵襲機(jī)體時，其能從完好的上皮組織移行到受侵襲的部位并攝取這些抗原[6]，DC表面受體在信號刺激下介導(dǎo)了此過程[7]。DC繼續(xù)遷移到局部引流淋巴結(jié)，提呈所攝取的抗原給相關(guān)的T淋巴細(xì)胞。相應(yīng)的炎性反應(yīng)就是在這些T淋巴細(xì)胞的介導(dǎo)下發(fā)生的。DC的遷移是趨化作用的結(jié)果，在趨化因子受體與相關(guān)的趨化因子間的相互作用下完成[8]。

1材料與方法

1.1實驗材料標(biāo)準(zhǔn)實驗用清潔級Wistar大鼠(共20只，雄性)，由第三軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供。二步法抗兔/鼠通用型免疫組化試劑盒(上?；蚩萍脊?，小鼠抗大鼠OX62單克隆抗體(R&D Systems公司)，兔抗-CD83多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)公司)，大鼠CCR6、CCR7酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海西唐生物科技公司)，羊抗鼠IgG-HRP(北京愛普華美生物科技公司)，LPS(Sigma公司)，香煙(遵義牌，煙氣煙堿量1.2 mg，焦油含量13 mg，煙氣一氧化碳量14 mg，貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司)。

1.2模型制備20只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：健康對照組(10只)、COPD組(10只)。使用香煙煙霧刺激和氣道內(nèi)注入LPS的方法制備COPD模型[9]：COPD組大鼠于第1天和第15天氣道內(nèi)注入LPS溶液(200 μg/200 μl)；第2～28天(第15天除外)于造模箱(由玻璃制成，25 cm×35 cm×80 cm，箱頂有直徑約2 cm的通氣孔，箱中部從下向上有兩排鐵網(wǎng)，鐵網(wǎng)間擺放并點(diǎn)燃香煙)內(nèi)被動吸煙(2次/d，香煙12支/次)。當(dāng)日2次被動吸煙造模間隔2 h，健康對照組不予上述處理。COPD組大鼠注射LPS日呼吸新鮮空氣，不給予上述煙霧刺激處理。

1.3標(biāo)本采集第29天分別選取兩組大鼠麻醉后開胸，結(jié)扎右肺，剪取右肺下葉予多聚甲醛溶液固定，制作石蠟標(biāo)本及病理切片，并行HE染色及免疫組織化學(xué)實驗。取右肺上葉放入低溫冷凍管，并置于液氮中保存?zhèn)溆?。在大鼠氣管下段做一倒“T”形切口，插入內(nèi)徑約1 mm塑料管，用注射器緩慢注入4 ℃ 0.9%氯化鈉溶液5 ml，并輕柔按摩大鼠肺臟行支氣管肺泡灌洗3次，將回抽的灌洗液保存，用于ELISA檢查。

1.4指標(biāo)檢測鏡下觀察COPD組HE染色的切片是否有COPD特征性病理改變表現(xiàn)，如氣道壁出現(xiàn)以中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤以及肺泡壁變薄、肺泡腔擴(kuò)大、破裂或形成大皰等改變。免疫組織化學(xué)實驗使用兩步法，分別用小鼠抗大鼠OX62(即CD103，下同)單克隆抗體和兔抗-CD83多克隆抗體作為一抗，稀釋濃度為1∶100，按試劑盒中的產(chǎn)品說明書的要求進(jìn)行操作。用PBS替代一抗作為陰性對照。光鏡下每張切片在陽性表達(dá)較高區(qū)隨機(jī)選取5個高倍視野(×400)，采圖后輸入軟件IPWIN 60中分析，計算積分光密度(IOD)的平均值代表樣本中OX62或CD83的表達(dá)強(qiáng)度，實驗重復(fù)4次。BALF中CCR6和CCR7表達(dá)水平的測定采用ELISA法，實驗重復(fù)4次。

2結(jié)果

2.1兩組大鼠肺組織的病理表現(xiàn)對照組：肺泡結(jié)構(gòu)完整連續(xù)，肺泡壁完好，小支氣管未見炎性細(xì)胞浸潤及腺體(見圖1，本文彩圖詳見本刊官網(wǎng)www.chinagp.net電子期刊相應(yīng)文章附件)。COPD組：部分肺泡間隔增寬，在增寬的肺泡間隔內(nèi)可看到毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，并伴有淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤；部分肺泡間隔出現(xiàn)變窄、斷裂或形成大皰(見圖2)，符合COPD的特征性病理表現(xiàn)特點(diǎn)。

圖1　對照組第29天肺組織病理(HE染色，×100)

圖2　COPD組第29天肺組織病理(HE染色，×100)

圖3　OX62表達(dá)于胞質(zhì)(免疫組織化學(xué)染色，×100)

圖4　CD83表達(dá)于胞質(zhì)(免疫組織化學(xué)染色，×400)

圖5　以PBS代替一抗的陰性對照(免疫組織化學(xué)染色，×400)

組別只數(shù)積分光密度(IOD)OX62 CD83健康對照組1017.1±3.343.4±14.3COPD組1073.4±5.414.8±5.6t值33.006.37P值<0.01<0.01

注：COPD=慢性阻塞性肺疾病

2.3兩組大鼠BALF中CCR6和CCR7表達(dá)水平比較COPD組BALF中CCR6表達(dá)水平高于健康對照組，CCR7表達(dá)水平低于健康對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01，見表2)。

Table2ComparisonoftheexpressionlevelsofCCR6andCCR7inBALFofratsbetweenthetwogroups

組別只數(shù)CCR6CCR7健康對照組10 43.6±5.5 41.7±7.4COPD組10105.8±2.710.4±3.1t值33.1516.08P值<0.01<0.01

3討論

COPD是以不完全可逆、呈進(jìn)行性發(fā)展的氣流受限為特征的氣道慢性炎性疾病[9]，吸煙和感染被公認(rèn)為COPD發(fā)病的兩個最主要的環(huán)境因素。本研究使大鼠被動吸煙并向其氣道注入LPS以模擬這一病理過程，28 d后COPD組病理改變結(jié)果與文獻(xiàn)報道一致[10]，且符合COPD病理的特征性表現(xiàn)。

國際上多項研究在COPD患者中發(fā)現(xiàn)了DC的數(shù)量和功能均發(fā)生了改變，這些發(fā)現(xiàn)提示其可能與COPD的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。但這些試驗所得到的結(jié)果并不相同。有研究發(fā)現(xiàn)在慢性香煙煙霧刺激下，小鼠肺部DC的數(shù)量明顯下降[11]。但也有研究發(fā)現(xiàn)COPD患者氣道中DC數(shù)量比吸煙無COPD者以及不吸煙者明顯增多[12]。

近年來，DC的成熟程度以及未成熟DC(immature DC，iDC)與成熟DC(mature DC，mDC)在疾病不同階段的不同作用備受關(guān)注。機(jī)體的DC源于骨髓，隨血流到達(dá)全身，成為具有攝取、處理抗原能力的iDC。當(dāng)外界抗原入侵時，iDC攝取入侵的抗原，并將其消化降解成含抗原決定簇的肽鏈，與細(xì)胞表面的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)結(jié)合，這些攜帶抗原-MHC復(fù)合物的DC游走至支氣管肺泡周圍的引流淋巴結(jié)，把抗原提呈給淋巴結(jié)中的T淋巴細(xì)胞[8]。在攜帶抗原的DC向引流淋巴結(jié)遷移的過程中，DC逐漸成熟，成熟過程中捕獲抗原的能力逐漸下降，提呈抗原的能力逐漸增強(qiáng)。

綜上所述，不同成熟度DC在COPD的發(fā)病中扮演不同的角色，本研究提示COPD組大鼠部分iDC可能在CCR6的作用下，被趨化到肺部，引起肺部DC的增多。同時，COPD大鼠肺臟局部mDC及其趨化因子受體CCR7減少，但其具體的作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步地深入研究。

本文的主要內(nèi)容：

本文檢測了不同成熟度的樹突細(xì)胞及其相關(guān)趨化因子受體在慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)未成熟樹突細(xì)胞及其趨化因子受體明顯增多，而成熟樹突細(xì)胞及其趨化因子受體顯著減少。這對于明確慢性阻塞性肺疾病的發(fā)病機(jī)制有一定的指導(dǎo)意義。

作者貢獻(xiàn)：孫得勝、歐陽瑤進(jìn)行課題設(shè)計與實施、資料收集整理、撰寫論文、成文并對文章負(fù)責(zé)；孫得勝、顧延會進(jìn)行課題實施、評估、資料收集；歐陽瑤進(jìn)行質(zhì)量控制及審校。

本文無利益沖突。

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(本文編輯：賈萌萌)

Changes of the Expressions of Dendritic Cells and Related Chemokine Receptors in the Lungs of Rats With COPD and Its Significance

SUNDe-sheng，OUYANGYao，GUYan-hui.

DepartmentofRespiratoryMedicine，AffiliatedHospitalofZunyiMedicalCollege，Zunyi563003，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the changes of the expressions of dendritic cells and related chemokine receptors CCR6 and CCR7 in the lungs of rats with COPD and its significance.MethodsTwenty clean healthy Wistar rats were selected and divided into health control group(n=10)and COPD group(n=10)using random number table method.In COPD group，COPD models were induced by cigarette smoke exposure and intratracheal injection of LPS.On the 29th day，the lung tissues of rats were obtained to make pathological sections.We observed the pathological changes of their lungs by HE staining，assayed the contents of CCR6 and CCR7 in the BALF by ELISA and evaluated the expression levels of DC and DC in their lungs by immunohistochemistry.ResultsThe HE staining results of the COPD models were consistent with the typical pathological features of COPD patients.The positive staining of OX(62) and CD(83) was mainly manifested as cytoplasm being the color of claybank.COPD group was higher in the expression levels of DC and was lower in the expression level of DC than health control group(P<0.01).COPD group was higher in the content of CCR6 in BALF and was lower in the content of CCR7 than health control group(P<0.01).ConclusionDCs and CCR6 increase but mature DCs and CCR7 decrease in COPD rat lungs.

【Key words】Pulmonary disease，chronic obstructive；Dendritic cells；Receptors，CCR6；Receptors，CCR7

(收稿日期：2015-11-16；修回日期：2016-01-10)

【中圖分類號】R 563.9

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1007-9572.2016.11.015

通信作者：歐陽瑤，563003貴州省遵義市，遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院呼吸一科；E-mail：ouyangyao116@sohu.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(81460008)