曹連賓+崔占鴻+孫紅梅+郝力壯+劉書(shū)杰

摘要： 以青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣全放牧牦牛和青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院舍飼牦牛瘤胃內(nèi)容物為樣本，對(duì)牦牛瘤胃細(xì)菌多樣性進(jìn)行分析及比較。使用細(xì)菌通用引物進(jìn)行瘤胃細(xì)菌16S rRNA基因序列的擴(kuò)增，以16S rRNA序列分析技術(shù)分析瘤胃細(xì)菌多樣性，并構(gòu)建16S rRNA基因克隆文庫(kù)。結(jié)果表明，放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細(xì)菌都主要分為兩大類(lèi)：Firmicutes類(lèi)和Bacteroidetes類(lèi)。放牧牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（79.52%）比舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（62.79%）要高，Bacteroidetes類(lèi)在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比舍飼牦牛（25.58%）要低。放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃內(nèi)纖維降解菌的差別不大，都為瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群，但舍飼牦牛瘤胃內(nèi)比放牧牦牛瘤胃內(nèi)的蛋白降解菌和淀粉降解菌更豐富。

關(guān)鍵詞： 牦牛；放牧；舍飼；瘤胃細(xì)菌；16S rRNA基因序列

中圖分類(lèi)號(hào)： S823.8+55 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2016）03-0242-07

青海作為中國(guó)牦牛第一大省，擁有豐富的牦牛資源，但放牧草場(chǎng)屬于高寒草甸類(lèi)型，牧草返青期時(shí)間短，枯黃期時(shí)間長(zhǎng)，枯黃期牧草營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)差難以消化利用，造成青海牦牛在冬季掉膘嚴(yán)重的現(xiàn)象，這些情況嚴(yán)重制約了青海牦牛業(yè)的發(fā)展。而牦牛舍飼情況下則能避免這一情況，但瘤胃細(xì)菌多樣性受日糧結(jié)構(gòu)影響顯著。An等（2005年）曾報(bào)道全放牧牦牛其瘤胃細(xì)菌比之黃牛（補(bǔ)飼）的細(xì)菌豐富度要低[1]。但是全放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細(xì)菌多樣性比較的研究至今尚未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料和方法

1.1 樣品采集

青海省黃南藏族自治州河南蒙古族自治縣牦牛屠宰廠3頭4歲牦牛瘤胃內(nèi)容物；舍飼牦牛瘤胃內(nèi)容物取自青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院3頭4歲舍飼牦牛瘤胃內(nèi)容物。全放牧牦牛飼料為天然牧草（四川嵩草、細(xì)果苔草、高山早熟禾），舍飼牦牛飼料（精料 ∶ 粗料=3 ∶ 7，粗料為燕麥青干草，精料原料為玉米、大豆粕、菜籽粕、麩皮）。

1.2 試劑及培養(yǎng)基

1.2.1 試劑 引物由上海生工生物工程有限公司合成；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨），EDTA（乙二胺四乙酸），NaCl，Tris-HCl（pH值為8.0），RNase，1 mol/L的IPTG（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷），20 mg/μL X-gal（β-半乳糖苷酶），100 mg/mL氨芐青霉素，瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒（QIAEX Ⅱ Gel Extraction Kit） 購(gòu)于QIAGEN 公司；PMD18-T Vector購(gòu)自TaKaRa公司。

1.2.2 培養(yǎng)基 液體LB培養(yǎng)基：1.0% 胰蛋白胨（tryptone），0.5% 酵母提取物（yeast extract），1.0% 氯化鈉（NaCl）。

固體LB培養(yǎng)基：1.0% 胰蛋白胨（tryptone），0.5% 酵母提取物（yeast extract），1.0%氯化鈉（NaCl），1.0% 瓊脂粉。

1.3 瘤胃微生物總DNA提取方法

稱取0.15 g瘤胃內(nèi)容物于研缽中，加入1.5 mL 1%CTAB抽提液（100 mmol/L Tris.HCI，pH值為8.0；100 mmol/L EDTA；100 mmol/L 磷酸鈉緩沖液，pH值為8.0；1.5 mol/L NaCl；1%CTAB），倒入液氮迅速研磨，始終保持研缽中存在液氮，研磨7～8次至研缽內(nèi)樣品成白色粉末狀，等其融化后倒入2 mL離心管內(nèi)，加入10 mg/mL蛋白酶K 20 μL和250 μL SDS（10%），65 ℃水浴2 h（每隔20 min顛倒混勻幾次），7 000 g，離心10 min，取上清。避開(kāi)上層漂浮物，取中層溶液，加入等體積酚 ∶ 氯仿 ∶ 異戊醇（25 ∶ 24 ∶ 1）抽提，12 000 g、4 ℃離心5 min，取上層溶液，重復(fù)操作1次，至上清不渾濁。然后用氯仿 ∶ 異戊醇（24 ∶ 1）抽提1次，12 000 g、4 ℃ 離心5 min，取上清。加入0.6倍體積的異丙醇，沉淀 2 h，12 000 g、4 ℃離心15 min，棄上清。用75%的乙醇洗滌沉淀，晾干，用 50 μL TE（pH值為8.0，含10 mg/μL RNase）溶解，37 ℃水浴30 min。

1.4 16S rRNA基因擴(kuò)增

以瘤胃總DNA逐級(jí)稀釋（稀釋5、10、25、50倍）作為模板，使用Premix Taq進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為50 μL，模板0.5 μL，引物（100 μmol/L）各0.1 μL，Premix Taq 25 μL，ddH2O 25 μL。引物為細(xì)菌通用引物：27 F 5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′和1492 R 5′-GGTTACCTTGTTACGACT T-3′。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.5 DNA的純化回收、克隆以及測(cè)序

選擇1.5 kb處條帶最清晰的稀釋倍數(shù)，使用瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒回收、純化其PCR產(chǎn)物。將純化回收的目的DNA片段與PMD18-T Vector連接。連接體系：1 μL載體，5 μL solution 1 ，4 μL DNA樣品，16 ℃條件下30 min。轉(zhuǎn)化：取感受態(tài)細(xì)胞，冰上融化感受態(tài)2 min，將10 μL上述連接體系加入到感受態(tài)中，冰上放置30 min，42 ℃熱激90 s，冰上放置3～5 min，加入500～700 μL液體LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床培養(yǎng)箱培養(yǎng)1 h。取AMP（氨芐青霉素）抗性LB平板，提前涂布4 μL 1 mol/L的IPTG和40 μL 20 mg/μL的X-gal于平板上，無(wú)菌操作臺(tái)上晾干。取轉(zhuǎn)化好的感受態(tài)，4 000 g離心 3 min，棄去部分上清液，留200 μL。用移液器將感受態(tài)細(xì)胞吹打混勻，取100 μL涂布平板，37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)過(guò)夜培養(yǎng)。氨芐青霉素抗性和藍(lán)白斑對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行初選，隨機(jī)挑取300個(gè)白色單菌落于高頻搖床上6～8 h氨芐青霉素抗性培養(yǎng)，使用引物M13F（-47）5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13R（-48）5′-AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3′進(jìn)行假陽(yáng)性檢驗(yàn)，將驗(yàn)證后的陽(yáng)性克隆菌液送交上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)通，測(cè)序引物使用M13F（-47） 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′和M13R（-48） 5′-AGCGGA TAACAATTTCACAC AGGA-3′。

1.6 序列分析

使用MEGA 6軟件中的ClustalW程序?qū)λ行蛄羞M(jìn)行比對(duì)，去掉序列前后的載體序列。Bellerophon軟件檢驗(yàn)嵌合體序列，去除可能的嵌合體序列[2]。使用Mothur軟件劃分序列OTU單位[3]，選取OTU代表序列，分類(lèi)學(xué)上相似性大于97%的序列可看做為同一個(gè)OTU單位。使用RDP11軟件[4]中的Classifer程序[5]對(duì)所有OTU代表序列進(jìn)行分類(lèi)。將OTU代表序列在NCBI的Blast程序中搜索相似性最高已知序列以及相似性最高的已知菌種序列[6]。將所有OTU代表序列用MEGA 6軟件中的ClustalW程序重新比對(duì)，建樹(shù)采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）[7]和Kimura雙參數(shù)距離模型，Bootstrap設(shè)置為1 000[4]，以大腸桿菌（Escherichia coli）作為外群[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 OTU操作單元?jiǎng)澐?/p>

青海省河南縣放牧牦牛瘤胃細(xì)菌97個(gè)序列劃分為83個(gè)OTUs，青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院舍飼牦牛瘤胃細(xì)菌118個(gè)序列劃分為86個(gè)OTUs。

2.2 RDP分類(lèi)

青海省河南縣牦牛瘤胃細(xì)菌有66個(gè)OTUS屬于厚壁菌門(mén)（Firmicutes），占總OTUS的79.52%。其中1個(gè)OTUS屬于未分類(lèi)的Firmicutes門(mén)；61個(gè)OTUS屬于Clostridia綱（占總OTUS的73.49%），除22個(gè)OTUS分屬未分類(lèi)的Clostridiales目外，剩余的39個(gè)OTUS分屬于Clostridiales目的Clostridiales_Incertae Sedis ⅩⅢ科（2個(gè)OTUS）、Ruminococcaceae科（18個(gè)OTUS）、Eubacteriaceae科（1個(gè)OTU）和Lachnospiraceae科（18個(gè)OTUS）；4個(gè)OTUS屬于Negativicutes綱（占總OTUS的4.82%），分屬于Selenomonadales目的Acidaminococcaceae科（3個(gè)OTUS）和Veillonellaceae科（1個(gè)OTU）。青海省河南縣牦牛瘤胃細(xì)菌有16個(gè)OTUS屬于擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes），占總OTUS的19.27%。其中2個(gè)OTUS屬于未分類(lèi)的Bacteroidetes門(mén)；14個(gè)OTUS屬于Bacteroidia綱（占總OTUS的16.87%），這14個(gè)OTUS中13個(gè)OTUS屬于未分類(lèi)的Bacteroidales目，剩余的1個(gè)OTU屬于Bacteroidales目的Prevotellaceae科。青海省河南縣牦牛瘤胃細(xì)菌有1個(gè)OTU屬于黏膠球形菌門(mén)（Lentisphaerae），歸類(lèi)于Oligosphaeria綱（占總OTUS的1.20%）的Oligosphaerales目Oligosphaeraceae科。

青海省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院舍飼牦牛瘤胃細(xì)菌的86個(gè)OTUs有54個(gè)OTUs（占總OTUs的62.79%）屬于Firmicutes菌門(mén)，其中48個(gè)OTUs屬于Clostridia菌綱，除6個(gè)OTU屬于未分類(lèi)的Clostridia菌綱外，其余42個(gè)OTUs分屬于Clostridiales目的Ruminococcaceae科（18個(gè)OTUs）、Lachnospiraceae科（21個(gè)OTUs）和Clostridiales_Incertae Sedis ⅩⅢ科（3個(gè)OTUs），其中5個(gè)OTUs屬于Negativicutes菌綱，分屬于Selenomonadales目的Veillonellaceae科（1個(gè)OTU）和Acidaminococcaceae科（4個(gè)OTUs）；86個(gè)OTUs有22個(gè)OTUs（占總OTUs的25.58%）屬于Bacteroidetes菌門(mén)，其中8個(gè)OTUs不能確定分類(lèi)，剩余的14個(gè)OTUs分屬于Bacteroidales目的Prevotellaceae科（8個(gè)OTUs）和Porphyromonadaceae科（6個(gè)OTUs）；86個(gè)OTUs中剩余的10個(gè)OTUs有7個(gè)OTUs（占總OTUs的8.14%）屬于Proteobacteria菌門(mén)，1個(gè)OTU屬于Verrucomicrobia菌門(mén)，1個(gè)OTU屬于Synergistetes菌門(mén)，還有1個(gè)OTU在細(xì)菌中不能確定其分類(lèi)地位可能為尚未發(fā)現(xiàn)的新屬。

RDP分類(lèi)結(jié)果中顯示，青海省河南縣放牧牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（79.52%）比之舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（62.79%）要高，Bacteroidetes類(lèi)在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比之舍飼牦牛（25.58%）要低。舍飼牦牛RDP分類(lèi)結(jié)果比之放牧牦牛要豐富。

2.3 16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3.1 青海省河南縣全放牧牦牛瘤胃細(xì)菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 83個(gè)OTUs中有6個(gè)OTUs與已培養(yǎng)細(xì)菌的相似性≥97%，占總OTUs的7.23%；20個(gè)OTUs與已培養(yǎng)細(xì)菌的相似性在90%～96%之間，占總OTUs的24.10%；57個(gè)OTUs與已培養(yǎng)細(xì)菌的相似性大于90%，占總OTUs的 68.67%。

將83個(gè)OTUs代表序列Blast后，取相似性≥97%的已知序列（53個(gè)序列）以及已培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌序列（6個(gè)序列）與這83個(gè)OTUs代表序列以大腸桿菌（Escherichia coli）為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。由圖1可以看出，系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上把所有序列分為3個(gè)部分：厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、黏膠球形菌門(mén)（Lentisphaerae）。同時(shí)，83個(gè)OTUs中有66個(gè)OTUs屬于Firmicutes，其中1個(gè)OTU（YAK-A91）與瘤胃解琥珀酸菌（Succiniclasticum ruminis）相似性97%，1個(gè)OTU（YAK-A30）與瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio ruminis）相似性99%，2個(gè)OTUs（YAK-A36、YAK-A80）與溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）相似性 98%～99%，1個(gè)OTU（YAK-A2）與亨氏丁酸弧菌（Butyrivibrio hungatei）相似性99%；83個(gè)OTUs中有16個(gè)OTUs屬于Bacteroidetes，其中1個(gè)OTU（YAK-A96）屬于帕萊斯氏血矛線蟲(chóng)（Haemonchus placei）相似性97%；83個(gè)OTUs中有1個(gè)OTU屬于Lentisphaerae。

YAK-A82序列屬于Firmicutes類(lèi)，但是從圖1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)上可以看出其并沒(méi)有與Firmicutes類(lèi)的其他序列歸在一起，其進(jìn)化距離較遠(yuǎn)。因此，YAK-A82可能是目前尚未發(fā)現(xiàn)的新的菌屬。

2.3.2 青海省舍飼牦牛瘤胃細(xì)菌16S rRNA基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析 86個(gè)OTUs中有8個(gè)OTUs與已培養(yǎng)細(xì)菌的相似性≥97%，占總OTUs的9.30%；34個(gè)OTUs與已培養(yǎng)細(xì)菌的相似性在90%～96%之間，占總OTUs的39.53%；44個(gè)OTUs與已培養(yǎng)細(xì)菌的相似性<90%，占總OTUs的51.16%。

將86個(gè)OTUs代表序列Blast比對(duì)后，取相似性≥97%的已知序列（54個(gè)序列）以及已培養(yǎng)瘤胃細(xì)菌序列（9個(gè)序列）與這86個(gè)OTUs代表序列以大腸桿菌（Escherichia coli）為外群構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，從系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析上可以發(fā)現(xiàn)所有序列主要分為2個(gè)部分：厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）。有1個(gè)序列歸類(lèi)到了Verrucomicrobia菌門(mén)。YAK39、YAK58、YAK74、YAK 80、YAK 81、YAK 93、YAK 111在RDP分類(lèi)中歸于Proteobacteria菌門(mén)，但從進(jìn)化樹(shù)上可以發(fā)現(xiàn)，這7個(gè)序列并沒(méi)有聚在一起，且進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，不能確定這7個(gè)系列的分類(lèi)地位。YAK21在RDP分類(lèi)中歸于Firmicutes這一類(lèi)，但從樹(shù)圖上發(fā)現(xiàn)，這一序列距離Firmicutes其他序列的進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，未歸于Firmicutes這一類(lèi)。由圖2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)可以看出86個(gè)OTUs中有54個(gè)OTUs屬于Firmicutes，其中1個(gè)OTU（YAK112）與瘤胃假丁酸弧菌（Pseudobutyrivibrio ruminis）相似性99%，2個(gè)OTUs（YAK59、YAK75）與羅斯伯里氏菌（Roseburia faecis ）相似性97%～98%，1個(gè)OTU（YAK73）與蛋白溶解梭菌（Clostridium proteoclasticum）相似性98%，1個(gè)OTU（YAK119）與溶纖維丁酸弧菌（Butyrivibrio fibrisolvens）相似性97%，1個(gè)OTU（YAK53）與黃色瘤胃球菌（Ruminococcus flavefaciens）相似性98%，2個(gè)OTUs（YAK103、YAK133）與瘤胃解琥珀酸菌（Succiniclasticum ruminis）相似性97%～98%，1個(gè)OTU（YAK91）與Anaerovibrio lipolyticus相似性97%；86個(gè)OTUs中有22個(gè)OTUs屬于Bacteroidetes。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)全放牧牦牛（97個(gè)序列共屬于83個(gè)OTUs），舍飼牦牛（118個(gè)序列共屬于86個(gè)OYUs）說(shuō)明不管放牧牦牛還是舍飼牦牛瘤胃微生物都非常豐富，比劉利等報(bào)道的廣西水牛瘤胃中的細(xì)菌多樣性（74個(gè)16S rRNA基因序列分屬于51個(gè)OTUs分類(lèi)單位）[9]和王遠(yuǎn)亮等報(bào)道的荷斯坦奶牛瘤胃細(xì)菌多樣性（45個(gè)16S rRNA序列分屬于28個(gè)OTUs分類(lèi)單位）[10]更豐富多樣。

由RDP分類(lèi)結(jié)果可以看出，放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細(xì)菌都主要分為2大類(lèi)：Firmicutes類(lèi)和Bacteroidetes類(lèi)。這與Edwards 等闡述的牛瘤胃細(xì)菌[11]和Koike等闡述的羊瘤胃細(xì)菌[12]主要分為2大類(lèi)LGCGPB類(lèi)和CFB類(lèi)結(jié)果相同。Yang等曾報(bào)道，荷斯坦奶牛、大額牛、水牛瘤胃細(xì)菌主要分為L(zhǎng)GCGPB和CFB2大類(lèi)[13]。Monica等也曾報(bào)道馴鹿瘤胃細(xì)菌主要分為L(zhǎng)GCGPB和CFB2大類(lèi)[14]。但青海省河南縣放牧牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（79.52%）比舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（62.79%）要高，Bacteroidetes類(lèi)在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比舍飼牦牛（25.58%）要低。An等曾報(bào)道的甘肅放牧牦牛（54.89%）比晉南舍飼黃牛（16.97%）瘤胃內(nèi)Firmicutes類(lèi)所占比例要高，而B(niǎo)acteroidetes類(lèi)所占比例晉南舍飼黃牛（38.99%）比甘肅放牧牦牛（34.78%）要高[1]。本試驗(yàn)結(jié)果與這一觀點(diǎn)相符。Fernando 等也曾報(bào)道反芻家畜在飼喂精料時(shí)，瘤胃內(nèi)Bacteroidetes類(lèi)占優(yōu)勢(shì)[15]。同時(shí)，在RDP分類(lèi)上，舍飼牦牛（歸類(lèi)于4個(gè)菌門(mén)）的分類(lèi)結(jié)果比放牧牦牛（歸類(lèi)于3個(gè)菌門(mén)）更加豐富，An等曾報(bào)道由于舍飼黃牛的日糧成分比放牧牦牛日糧成分更為復(fù)雜，使其瘤胃微生物更加復(fù)雜多樣[1]。

溶纖維丁酸弧菌、白色瘤胃球菌、黃色瘤胃球菌、產(chǎn)琥珀酸絲狀桿菌是瘤胃內(nèi)主要的纖維降解菌，而后三者又是公認(rèn)的瘤胃內(nèi)纖維降解的優(yōu)勢(shì)菌群；同時(shí)溶纖維丁酸弧菌還與瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)的降解有關(guān)系；瘤胃解琥珀酸菌可以將瘤胃內(nèi)的琥珀酸轉(zhuǎn)化為丙酸，是瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)菌種[15]；瘤胃假丁酸弧菌、羅斯伯里氏菌的主要作用是發(fā)酵瘤胃各種碳水化合物，主產(chǎn)物為丁酸[16]；Anaerovibrio lipolyticus菌是瘤胃內(nèi)主要淀粉降解菌之一[17]；亨氏丁酸弧菌能進(jìn)行少量的乳酸發(fā)酵，且是瘤胃內(nèi)生成乙酸的重要微生物之一[18]；蛋白溶解梭菌有降解瘤胃蛋白質(zhì)的作用。由圖1系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)上可以看出，放牧牦牛瘤胃內(nèi)共檢測(cè)到6株已培養(yǎng)細(xì)菌分別為1株瘤胃解琥珀酸菌、1株瘤胃假丁酸弧菌、2株溶纖維丁酸弧菌、1株亨氏丁酸弧菌、1株帕萊斯氏血矛線蟲(chóng)；由圖2可以看出，舍飼牦牛瘤胃內(nèi)9株已培養(yǎng)細(xì)菌分別為1株瘤胃假丁酸弧菌、2株羅斯伯里氏菌、1株蛋白溶解梭菌、1株溶纖維丁酸弧菌、1株黃色瘤胃球菌、2株瘤胃解琥珀酸菌、1株Anaerovibrio lipolyticus。由此可以發(fā)現(xiàn)放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃內(nèi)都檢測(cè)到了纖維降解菌的存在，其差別不明顯。但是舍飼牦牛瘤胃內(nèi)檢測(cè)到了1株主要蛋白降解菌（蛋白溶解梭菌）和1株降解淀粉的細(xì)菌（Anaerovibrio lipolyticus），這2種細(xì)菌在放牧牦牛瘤胃內(nèi)未檢測(cè)到。這是因?yàn)樯犸曣笈５娜占Z中添加有精料，而精料中蛋白質(zhì)和淀粉含量比之天然牧草要高，致使瘤胃內(nèi)蛋白質(zhì)降解菌和淀粉降解菌的菌群數(shù)量增加。Coe等曾報(bào)道當(dāng)給反芻家畜飼喂精料時(shí)，其瘤胃內(nèi)淀粉降解菌的數(shù)量和種類(lèi)會(huì)增加[19-21]。同時(shí)，舍飼牦牛瘤胃內(nèi)檢測(cè)到的產(chǎn)丁酸菌的種類(lèi)（1株瘤胃假丁酸弧菌、2株羅斯伯里氏菌）比放牧牦牛瘤胃內(nèi)檢測(cè)到的產(chǎn)丁酸菌的種類(lèi)（1株瘤胃假丁酸弧菌）要多。溶纖維丁酸弧菌在舍飼牦牛瘤胃內(nèi)（1株溶纖維丁酸弧菌）和放牧牦牛瘤胃（2株溶纖維丁酸弧菌）內(nèi)都有檢測(cè)到且差別不明顯，這可能是因?yàn)槿芾w維丁酸弧菌除了降解纖維素外，對(duì)于瘤胃蛋白的降解也有作用有關(guān)，致使這2種條件下日糧的不同對(duì)溶纖維丁酸弧菌的影響不大。

4 結(jié)論

放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃細(xì)菌都主要分為2大類(lèi)：Firmicutes類(lèi)和Bacteroidetes類(lèi)。放牧牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（79.52%）比舍飼牦牛瘤胃Firmicutes類(lèi)所占比例（6279%）要高，Bacteroidetes類(lèi)在瘤胃內(nèi)所占比例放牧牦牛（19.27%）比舍飼牦牛（25.58%）要低。放牧牦牛與舍飼牦牛瘤胃內(nèi)纖維降解菌的差別不大，都為瘤胃內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌群，但舍飼牦牛瘤胃內(nèi)比放牧牦牛瘤胃內(nèi)的蛋白質(zhì)降解菌和淀粉降解菌更豐富。

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