◎楊 雪，李云亮，王禹程，黃姍芬，馬海樂

（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江 212013）

油菜籽在我國(guó)油料作物中占重要地位，年產(chǎn)量達(dá)1 400萬t以上[1]。菜籽粕是食品工業(yè)生產(chǎn)中菜籽榨油后的副產(chǎn)物，約占油菜籽的50%～55%[2]。菜籽粕中的蛋白含量高達(dá)30%～45%，其生物效價(jià)和利用率極高，甚至超過脫脂大豆粕和酪蛋白[3,4]，是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源。然而每年僅有少數(shù)菜籽粕摻入飼料使用，其余未被有效利用，造成大量經(jīng)濟(jì)損失和資源浪費(fèi)。

菜籽粕中含有毒性成分，如硫甙、植酸、單寧和芥子堿等。硫甙本身無毒，但其經(jīng)芥子酶可分解成異硫氰酸酯、惡唑烷硫酮和腈等有毒物，嚴(yán)重影響菜籽粕的應(yīng)用價(jià)值[5,6]，在使用前須進(jìn)行脫毒處理。目前常用的脫毒方法包括物理脫毒法、化學(xué)脫毒法和生物脫毒法。有研究表明，采用硫酸溶液脫毒后菜籽粕中毒性物質(zhì)的脫除率高于90%，且蛋白質(zhì)的含量升高、氨基酸組成基本維持不變[7]。

多肽的生物學(xué)活性研究是食品科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一[8,9]，有研究表明，菜籽蛋白經(jīng)過酶解形成的菜籽多肽有一定的保健功效，尤其是抗氧化活性[10]及降血壓活性[11]。此外，菜籽多肽還有其他生物學(xué)功能，如解酒[12]、抗腫瘤[13]等。因此，開發(fā)菜籽多肽有助于提高菜籽粕資源的利用[14]。而長(zhǎng)期食用脫毒后的菜籽蛋白制備的菜籽多肽是否對(duì)機(jī)體會(huì)產(chǎn)生毒副作用還有待探索。

本試驗(yàn)以小鼠為研究對(duì)象，進(jìn)行急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)、骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)和睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)，對(duì)脫毒菜籽多肽的食用安全性進(jìn)行初步評(píng)價(jià)，為進(jìn)一步的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品

脫毒菜籽多肽（多肽含量≥85%，江蘇天琦生物科技有限公司，江蘇鎮(zhèn)江）。

1.1.2 菌株

經(jīng)鑒定基因型符合要求的TA97a、TA98、TA100和TA102，各菌株過夜培養(yǎng)液細(xì)菌濃度均在109個(gè)/mL或以上。

1.1.3 S9混合液

由Aroclor1254誘導(dǎo)的大鼠肝勻漿制成10% S9混合液。

1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物

健康ICR小鼠95只，其中雄性60只、雌性35只。分成3批進(jìn)行試驗(yàn)，第一批20只，雌雄各半，體重18.5～21.6 g，用于小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)。第二批50只，雌雄各半，體重25～30 g，用于小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)。第三批25只雄性小鼠，體重25～30 g。用于小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)。南京醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，清潔級(jí)，合格證號(hào)：SCXK（蘇）2013-0005 號(hào)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物屏障環(huán)境設(shè)施使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2012-0037 號(hào)。滅菌鼠飼料來源及合格證號(hào)：蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司，蘇飼審（2009）05032。飼料和無菌水自由食用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

采用最大耐受量試驗(yàn)法（GB 15193.3-2014），每組雌雄小鼠各10只，設(shè)計(jì)劑量為15 g/kg·BW，分兩次灌胃給予，間隔4 h，每次灌胃容量均為20 mL/kg·BW。

1.2.2 鼠傷寒沙門菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)

利用平板摻入法測(cè)定（GB 15193.4-2014），試驗(yàn)共設(shè)5個(gè)劑量組，1個(gè)溶劑對(duì)照組，一個(gè)空白對(duì)照組即自發(fā)回變組，另設(shè)4個(gè)陽性對(duì)照組，陽性對(duì)照物疊氮鈉（NaN3）、敵克松（Dexon）、2-氨基芴（2-AF）和1,8-二羥基蒽醌分別用滅菌水和DMSO溶解，所用劑量分別為1.5、50、10、50 μg/皿。

1.2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

參照GB 15193.5-2014，小鼠分雌雄按體重隨機(jī)分入2.5、5、10 g/kg·BW各3個(gè)劑量組、1個(gè)溶劑對(duì)照組（純凈水）和1個(gè)陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg·BW），每組10只，雌雄各半。各組均采用30 h兩次灌胃法，每次灌胃容量為20 mL/kg·BW，第2次灌胃后6 h殺鼠，取股骨骨髓懸于小牛血清中直接涂片、固定、染色，鏡檢嗜多染紅細(xì)胞1 000個(gè)/鼠，計(jì)數(shù)具有微核的細(xì)胞，觀察嗜多染紅細(xì)胞和正染紅細(xì)胞比率（PCE/NCE）。

1.2.4 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)

參照GB 15193.8-2014，分別稱取脫毒菜籽多肽2.5、5、10 g加純凈水至20 mL配制成受試劑量。陽性對(duì)照取環(huán)磷酰胺40 mg加生理鹽水至10 mL混合均勻。小鼠按體重隨機(jī)分入3個(gè)劑量組、1個(gè)溶劑對(duì)照組（純凈水）和1個(gè)陽性對(duì)照組（環(huán)磷酰胺40 mg/kg·BW），每組5只小鼠。陽性對(duì)照組連續(xù)5 d，每次灌胃容量均為20 mL/kg，每天一次。各組動(dòng)物均于處死前6 h腹腔注射秋水仙素4 mg/kg，試驗(yàn)第14 d殺鼠取睪丸，拉開曲細(xì)精管，低滲，固定，軟化，制片，染色，鏡檢，觀察細(xì)胞數(shù)100個(gè)/只。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各項(xiàng)測(cè)定指標(biāo)均用spss16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)

觀察小鼠灌胃后兩周內(nèi)的體重以及中毒表現(xiàn)，脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠體重的影響見表1。

表1 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠體重的影響表

表1 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠體重的影響表

?

從表1可以看出，脫毒菜籽多肽對(duì)動(dòng)物體重增長(zhǎng)無明顯影響。經(jīng)口給予動(dòng)物后未見明顯中毒表現(xiàn)，觀察期內(nèi)無動(dòng)物死亡。脫毒菜籽多肽對(duì)雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量均大于1.5 g/kg·BW，根據(jù)小鼠急性經(jīng)口毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，該脫毒菜籽多肽屬無毒級(jí)。

2.2 鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)

脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠傷寒沙門菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)結(jié)果表

表2 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠傷寒沙門菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)結(jié)果表

?

由表2中結(jié)果可知，兩次試驗(yàn)各劑量組的回變菌落數(shù)，不論加S9與否均為超過相應(yīng)的溶劑對(duì)照值的兩倍，也無劑量-反應(yīng)關(guān)系。劑量達(dá)5 000 μg/皿，不論加S9與否，脫毒菜籽多肽對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株TA97a、TA98、TA100和TA102均未檢出明顯的誘變活性。

2.3 小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)

脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果表

表3 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果表

?

各菜籽多肽受試物的微核率與溶劑對(duì)照組相比，均無顯著性差異，也無劑量-反應(yīng)關(guān)系，陽性對(duì)照組微核率與溶劑對(duì)照組相比則有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＜0.01）。受試物各劑量組動(dòng)物的PCE占紅細(xì)胞總數(shù)的比例不少于對(duì)照組的20%，提示骨髓紅細(xì)胞系統(tǒng)的增殖并無明顯受抑，對(duì)嗜多染紅細(xì)胞微核的觀察無明顯影響。在2.5、5、10 g/kg受試劑量下，脫毒菜籽多肽沒有對(duì)雌雄小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞致微核作用。

2.4 小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)

脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果見表4。

表4 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果表

表4 脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞染色體畸變?cè)囼?yàn)結(jié)果表

a：斷裂、斷片、三價(jià)體、四價(jià)體等，★★：與對(duì)照值比較P＜0.01。

?

脫毒菜籽多肽各劑量組小鼠具有染色體畸變的初級(jí)精母細(xì)胞率與溶劑對(duì)照值之間均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，也無劑量-反應(yīng)關(guān)系。陽性對(duì)照值與溶劑對(duì)照值之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異（P＜0.01）。在2.5、5、10 g/kg受試劑量下，脫毒菜籽多肽沒有對(duì)雄性小鼠睪丸初級(jí)精母細(xì)胞染色體的誘變活性。

3 討論

本文通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)、鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)、小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)、小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)研究了脫毒菜籽多肽毒理學(xué)特性。急性毒性試驗(yàn)中，脫毒菜籽多肽對(duì)雌雄小鼠經(jīng)口最大耐受劑量均大于15 g/kg·BW。鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)可在基因水平上反映生物體遺傳物質(zhì)的損傷情況，本實(shí)驗(yàn)中，脫毒菜籽多肽的添加劑量達(dá)5 mg/皿時(shí)，加及不加S9對(duì)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)試菌株TA97a、TA98、TA100和TA102均沒有明顯誘變活性，說明飼喂脫毒菜籽多肽以后，小鼠既沒有間接誘變活性，也沒有直接誘變活性。小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)可以反映受試物對(duì)哺乳動(dòng)物骨髓細(xì)胞染色體的作用能力，以檢測(cè)致突變物對(duì)遺傳物質(zhì)的損傷情況。小鼠睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)反映了生殖系統(tǒng)在外來誘變劑作用下的變異現(xiàn)象。這2項(xiàng)遺傳毒性試驗(yàn)結(jié)果均為陰性，表明脫毒菜籽多肽對(duì)體細(xì)胞和生殖細(xì)胞沒有致突變性。

4 結(jié)論

通過小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)可知，脫毒菜籽多肽屬于無毒級(jí)；通過鼠傷寒沙門氏菌/哺乳動(dòng)物微粒體酶試驗(yàn)可知，脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠既沒有間接誘變活性，也沒有直接誘變活性；通過小鼠骨髓細(xì)胞微核試驗(yàn)可知，脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠遺傳物質(zhì)無損傷作用；通過睪丸染色體畸變?cè)囼?yàn)可知，脫毒菜籽多肽對(duì)小鼠生殖系統(tǒng)無誘變作用。

由此可得出最終結(jié)論，脫毒菜籽多肽具有良好的食用安全性，可以作為一種保健食品原料進(jìn)行開發(fā)、利用。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉敏佳.菜籽粕的抗?fàn)I養(yǎng)因子及其脫毒研究進(jìn)展[J].湖北畜牧獸醫(yī)，2016，37（3）：9-12.

[2]丁 艷，李麗倩，曹 蓉，等.油菜籽餅粕中硫苷的酶解條件優(yōu)化及降解產(chǎn)物分析[J].中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（2）：383-393.

[3]Berot S，Compoint J，Larre C，et al. Large scale purification of rapeseed proteins （Brassica napusl L.)[J].Journal of Chromatography B，2005，818（1）：35-42.

[4]Yoshie S Y，Wada Y，Schott M，et al.Functional and bioactive properties of rapeseed protein concentrates and sensory analysis of food application with rapeseed protein concentrates[J]. LWT-Food Science and Technology，2006，39（5）：503-512.

[5]邱良偉，顧擁建，沙文鋒，等.復(fù)合微生物固態(tài)發(fā)酵菜籽粕的研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，43（3）：209-211.

[6]羅倉學(xué)，史 蘭，李振堯.菜籽粕脫毒及菜籽蛋白提取工藝優(yōu)化[J].食品與發(fā)酵科技，2013，19（6）：50-54.

[7]蘭文菊，彭密軍，彭 勝，等.酸溶液對(duì)菜籽粕脫毒工藝探討[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào)，2012，27（11）：67-71.

[8]Yoon K A，Kim K，Kim A Y，et al.Selective antitumor activities of venom peptides from the lesser paper wasp Parapolybia varia[J]. Journal of Asia-Pacific Entomology，2016，19（3）：821-828.

[9]Kim H，Jang J H，Kim S C，et al.Enhancement of the antimicrobial activity and selectivity of GNU7 against Gramnegative bacteria by fusion with LPS-targeting peptide[J].Peptides，2016，82（5）：60-66.

[10]He Rong，Ju Xingrong，Yuan Jian，et al. Antioxidant activities of rapeseed peptides produced by solid state fermentation[J].Food Research International，2012，49（1）：432-438.

[11]Makinen S，Streng T，Larsen L B，et al. Angiotensin I-converting enzyme inhibitory and antihypertensive properties of potato and rapeseed protein-derived peptides[J].Journal of Functional Foods，2016，25：160-173.

[12]王薇星.菜籽蛋白的制備及其酶解產(chǎn)物的醒酒功效[D].金華：浙江師范大學(xué)，2012.

[13]曾曉波，吳謀成，李小定，等.菜籽肽對(duì)S180腫瘤細(xì)胞體外生長(zhǎng)影響的研究[J].營(yíng)養(yǎng)學(xué)報(bào)，2004，26（3）：216-219.

[14]Wang Bei，Meng Tingting，Ma Haile，et al.Mechanism study of dual-frequency ultrasound assisted enzymolysis on rapeseed protein by immobilized Alcalase[J].Ultrasonics Sonochemistry，2016，32（3）：307-313.