摘要：目的 建立10%尿素乳膏的微生物限度檢查方法。方法 常規(guī)法。結(jié)論 需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)采用常規(guī)的平皿傾注法，控制菌的檢查采用常規(guī)法。

關(guān)鍵詞：10%尿素乳膏；微生物限度檢驗(yàn)法；方法適用性試驗(yàn)

Study on the Aapplicability Test of Microbial Limits Test of 10% Urea Cream

FANG Min

（Institute for Food and Drug Control，Suzhou 234000，Anhui，China）

Abstract：Objective To establish microbial limit test for 10% urea cream .Methods Common method.Conclusion Routine pour-plate method was used for the total aerobic microbial count，total yeasts and mold count. The conventional method can be used for the test of control bacteria.

Key words：10% urea cream； Microbial limits test；Applicability test

尿素乳膏，為皮膚外用藥。適用于皮膚角化癥，手足皸裂，干皮癥、魚鱗病等。為保證所采用的檢驗(yàn)方法適合于該藥品的需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)的計(jì)數(shù)以及控制菌的檢查，確認(rèn)供試液制備、測定方法及檢測系統(tǒng)適用于該藥品的檢驗(yàn)，本文參照《中國藥典》[1]2015年版第三部通則\"1105 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：微生物計(jì)數(shù)法\"以及\"1106 非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查：控制菌檢查法\"、《中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范》[2]，建立10%尿素乳膏微生物限度檢驗(yàn)方法并進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1試驗(yàn)環(huán)境 根據(jù)2015年版《中國藥典》第三部\"9203藥品微生物質(zhì)量管理原則\"[3]規(guī)定，試驗(yàn)在環(huán)境潔凈度B級、局部潔凈度A級的單向流空氣的無菌室進(jìn)行，陽性菌操作在符合國家Ⅱ級生物安全標(biāo)準(zhǔn)的生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。

1.2實(shí)驗(yàn)儀器 MJX-160B-Z型微電腦霉菌培養(yǎng)箱（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、DYX-DHS型隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠）、GHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海金慧科電子有限公司）、BHC-1300ⅡA2型生物安全柜（蘇州蘇凈儀器自控設(shè)備有限公司）、YXQ-LS-75SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海市博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）、TZQ-Ⅱ型勻質(zhì)器型號（天津市津德實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)開發(fā)中心）。

1.3供試品 10%尿素乳膏，宿州億帆藥業(yè)有限公司（批號：160101，160102，160103）。

1.4稀釋劑 0.1%無菌吐溫溶液、pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液（自配）。

1.5培養(yǎng)基 胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）（批號為20151211

0-00）、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（TSA）（批號為20160111-00）、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（SDA）（批號為20151110-00）、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基（批號為20150716-00）、溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養(yǎng)基（批號20151026-00）。以上均由杭州微生物試劑有限公司提供。

根據(jù)2015年版《中國藥典》第三部通則的規(guī)定，計(jì)數(shù)培養(yǎng)基符合計(jì)數(shù)培養(yǎng)基適用性檢查的要求；控制菌檢查用培養(yǎng)基符合促生長能力、抑制能力及指示特性的要求。

1.6試驗(yàn)菌種 枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B） 63 501]、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B） 26 003]、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B） 10 104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F） 98 001]、黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC（F） 98 003] ，試驗(yàn)用菌株的傳代次數(shù)為3代。

所用菌種，黑曲霉菌由中國藥品生物制品檢定所提供，其余菌種均由中國醫(yī)學(xué)菌種保藏中心提供。

2 結(jié)果

2.1菌液的制備與檢驗(yàn)

2.1.1菌液的制備 取經(jīng)35℃培養(yǎng)18～24 h的枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的TSB培養(yǎng)物1 ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋，枯草芽孢桿菌至10-5、銅綠假單胞菌至10-6、金黃色葡萄球菌至10-8，備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)2～3 d的白色念珠菌液體培養(yǎng)物1 ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-5，做活菌計(jì)數(shù)備用；取經(jīng)25℃培養(yǎng)1 w的黑曲霉斜面培養(yǎng)物，加4ml pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液洗下黑曲霉孢子，吸取出孢子懸液1 ml，用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液10倍遞增稀釋至10-6，做活菌計(jì)數(shù)備用。

2.1.2菌液的檢驗(yàn) 取2.1.1銅綠假單胞菌10-6、枯草芽孢桿菌10-5、金黃色葡萄球菌10-8、白色念珠菌10-5稀釋液及上述黑曲霉10-6孢子懸液各0.1 ml，分別用45℃胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基20 ml注皿，各平行測定兩皿，銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌30℃～35℃培養(yǎng)3 d，計(jì)數(shù)；白色念珠菌、黑曲霉30℃～35℃培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)，均應(yīng)不大于100cfu；取上述白色念珠菌10-5稀釋液及上述黑曲霉10-6孢子懸液各0.1 ml，分別用45℃沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基20 ml注皿，各平行測定兩皿，20℃～25℃培養(yǎng)培養(yǎng)5 d，計(jì)數(shù)，均應(yīng)不大于100cfu。試驗(yàn)結(jié)果見表1，符合要求。

2.2供試液制備 隨機(jī)取兩支供試品（10g/支），混合，按非無菌產(chǎn)品微生物限度檢查法供試品檢查規(guī)定稱取10g，加40℃無菌0.1%吐溫溶液至100 ml，用勻漿儀混和均勻，即為1：10的供試品溶液。

2.3需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)方法的適用性試驗(yàn) 采用常規(guī)法（即平皿傾注法）進(jìn)行3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)。

2.3.1試驗(yàn)組：取1：10供試液10 ml，加上述試驗(yàn)菌液0.1 ml，使每1 ml供試液中含菌量不大于100cfu，取供試液1 ml，置直徑90 mm的無菌平皿中，立即注入15～20 ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.3.2菌液對照組：取稀釋液代替供試液，按試驗(yàn)組操作。

2.3.3供試品對照組：取制備好的供試液，以無菌0.1%吐溫溶液代替菌液同試驗(yàn)組操作。

2.3.4陰性對照：取無菌0.1%吐溫溶液1 ml置90 mm的無菌平皿中，立即注入15～20 ml溫度不超過45℃熔化的胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基或沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，平行制備2個(gè)平皿，待凝固后置規(guī)定溫度培養(yǎng)3～5 d，逐日觀察結(jié)果并記錄。

2.3.5實(shí)驗(yàn)結(jié)果：試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對照組的平均菌落數(shù)的值與菌液對照組平均菌落數(shù)的比值應(yīng)在0.5～2范圍內(nèi)。結(jié)果見表2、表3（結(jié)果為兩皿的平均值）。

從表2、表3可以看出3次平行試驗(yàn)，試驗(yàn)組的菌落數(shù)減去供試品對照組的菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值均在0.5～2范圍內(nèi)。

2.4控制菌檢查方法的適用性試驗(yàn) 銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查方法的適用性試驗(yàn)：按常規(guī)法進(jìn)行三次平行試驗(yàn)。

2.4.1試驗(yàn)組：分別取1：10供試液10 ml及上述不大于100cfu的銅綠假單胞菌或金黃色葡萄球菌1 ml，分別接種置90 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24 h，按相應(yīng)的控制菌檢查法檢查。

2.4.2菌液對照組：取稀釋液代替供試液，同試驗(yàn)組操作。

2.4.3供試品對照組：取1：10供試液10 ml，以無菌0.1%吐溫溶液代替菌液同試驗(yàn)組操作。按相應(yīng)的控制菌檢查法檢查。

2.4.4陰性對照組：取無菌0.1%吐溫溶液11 ml，接種置90 ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中，混勻，置35℃培養(yǎng)18～24 h，按相應(yīng)的控制菌檢查方法檢查。

2.4.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：控制菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果見表4。

由表4方法適用性試驗(yàn)結(jié)果可以看出銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌菌液對照組、試驗(yàn)組生長良好，說明尿素乳膏對銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌無抑菌作用或抑菌作用較弱。

3 討論

3.1由上述驗(yàn)證結(jié)果可知，在需氧菌總數(shù)、霉菌和酵母菌總數(shù)計(jì)數(shù)檢查的方法適用性試驗(yàn)中，常規(guī)法對金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收試驗(yàn)均符合要求（即試驗(yàn)組菌落數(shù)減去供試品對照組菌落數(shù)的值與菌液對照組菌落數(shù)的比值均在0.5～2范圍內(nèi)）；從表4可以看出控制菌銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌的檢查可采用常規(guī)法。

3.2為防止陽性菌造成的環(huán)境污染，涉及陽性菌的試驗(yàn)均在陽性室的生物安全柜內(nèi)操作。

3.3方法適用性試驗(yàn)需進(jìn)行三次平行的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)，所加的培養(yǎng)基體積應(yīng)盡量一致，培養(yǎng)基與所加試液應(yīng)充分混合均勻。

3.4乳膏供試品不易混和均勻，故實(shí)驗(yàn)過程中采用勻漿儀進(jìn)行攪拌混合。

參考文獻(xiàn)：

[1]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典[S].中國醫(yī)藥科技出版社，2015年版三部：通則80-通則90.

[2]中國藥品生物制品檢定所，中國藥品檢驗(yàn)總所.中國藥品檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)范[S].中國醫(yī)藥科技出版社.2010年版：351-369.

[3]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典[S].中國醫(yī)藥科技出版社，2015：220-221.編輯/金昊天