葉潤(rùn)燕，童再康，張俊紅，朱玉球（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

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樟樹莖段組培快繁

葉潤(rùn)燕，童再康，張俊紅，朱玉球
（浙江農(nóng)林大學(xué)亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，浙江臨安311300）

摘要：以當(dāng)年生樟樹Cinnamomum camphora帶芽莖段為外植體，研究6-芐基腺膘呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）在初代培養(yǎng)和繼代培養(yǎng)過(guò)程中對(duì)樟樹莖段腋芽及叢生芽誘導(dǎo)增殖的影響。結(jié)果表明：最適腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS（Murashige and Skoog）＋1.00 mg·L(－1)6-BA＋（0.01～0.10 mg·L(－1)）NAA。繼代培養(yǎng)時(shí)采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行培養(yǎng)基篩選，經(jīng)極差分析和方差分析得知叢生芽發(fā)生率較高的培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L(－1)6-BA＋0.10 mg·L(－1)NAA，而叢生芽增殖最佳培養(yǎng)基為MS＋（0.50～1.00）mg·L(－1)6-BA。將無(wú)菌苗轉(zhuǎn)入最適生根培養(yǎng)基1/2MS＋1.50 mg·L(－1)NAA，生根率可達(dá)90%；生根的無(wú)菌苗移栽至m（蛭石）∶m（泥炭）為1∶1的混合基質(zhì)中，經(jīng)過(guò)15~20 d練苗，95%以上無(wú)菌苗均能成活。這一結(jié)果為樟樹優(yōu)良品種的工業(yè)化育苗奠定了技術(shù)基礎(chǔ)。圖2表5參13

關(guān)鍵詞：森林培育學(xué)；樟樹；叢生芽；無(wú)性快繁；組織培養(yǎng)

樟樹Cinnamomum camphora又名香樟，樹型優(yōu)美，適應(yīng)性廣，是傳統(tǒng)的綠化觀賞喬木樹種。同時(shí)，樟樹木材品質(zhì)優(yōu)異，用途獨(dú)特，屬珍貴用材樹種。然而，對(duì)天然資源的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，多數(shù)樟樹樹干分枝較低，出材率不高，只有極少數(shù)優(yōu)良單株的干形通直，分枝高，出材率高。若這些優(yōu)良單株通過(guò)有性繁殖其優(yōu)良基因型不能固定，則后代分離嚴(yán)重，且多數(shù)劣變［1-2］，因此，通過(guò)無(wú)性擴(kuò)繁是固定樟樹優(yōu)良基因型的必然途徑。無(wú)性繁殖主要包括扦插和組織培養(yǎng)兩方面，但扦插繁殖受實(shí)驗(yàn)材料和季節(jié)的限制，繁殖系數(shù)較低［3］。組織培養(yǎng)技術(shù)可克服扦插繁殖存在的問(wèn)題，不受材料和季節(jié)的限制可獲得大量無(wú)性系。樟樹莖段組培快繁技術(shù)的研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。據(jù)相關(guān)研究報(bào)道［4－7］，6-芐基腺膘呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）的不同配比是影響樟樹腋芽誘導(dǎo)率以及叢生芽增殖系數(shù)高低的關(guān)鍵，故如何篩選出叢生芽增殖系數(shù)較高的培養(yǎng)基配比方案，提高樟樹繁殖的效率和效益，已成為樟樹優(yōu)良品種產(chǎn)業(yè)化的關(guān)鍵問(wèn)題。因此，本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以初代培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗為外植體，研究了基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA 等3個(gè)因素對(duì)樟樹叢生芽誘導(dǎo)與增殖的影響，以期獲得樟樹叢生芽增殖最佳之方案。同時(shí)探索試管苗生根［8］、練苗與移栽［9］等環(huán)節(jié)，力求得到試管苗移栽高成活率的方法。

1　材料與方法

1.1材料

樟樹外植體莖段均來(lái)自于浙江農(nóng)林大學(xué)遺傳學(xué)科種質(zhì)資源苗圃地選育的具有優(yōu)良性狀的個(gè)體。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1培養(yǎng)基針對(duì)叢生芽誘導(dǎo)增殖和生根的最佳培養(yǎng)基，設(shè)計(jì)了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比，包括6-BA和NAA以及3-吲哚丁酸（IBA）的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選。所用基本培養(yǎng)基無(wú)特殊說(shuō)明均為MS（Murashige and Skoog）培養(yǎng)基，添加蔗糖30.00 g·L－1，瓊脂5.50 g·L－1，pH 5.90。莖段和叢生芽數(shù)均為30個(gè)·處理－1，接3個(gè)·瓶－1，共10瓶，重復(fù)3次·處理－1。培養(yǎng)溫度（25±2）℃，光照強(qiáng)度1 500 lx，光照時(shí)間為12 h·d－1。

1.2.2無(wú)菌苗的獲得選取當(dāng)年生半木質(zhì)化、無(wú)病蟲害、健壯的樟樹莖段為外植體。進(jìn)行材料處理時(shí)，首先去掉葉片，用漂白粉漂洗10~15 min，在流動(dòng)的自來(lái)水中沖洗1~2 h，拭干水分待用。在無(wú)菌室內(nèi)的超凈工作臺(tái)上用0.75 kg·L－1乙醇處理30 s，無(wú)菌蒸餾水沖洗3次后，1.00 g·L－1升汞滅菌10 min，再用無(wú)菌蒸餾水沖洗5~7次，洗去殘余升汞。將消毒后的外植體剪成1.00~1.50 cm長(zhǎng)帶1~2個(gè)腋芽的莖段，快速接種在添加不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比的A1~A6培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個(gè)月。

1.2.3叢生芽的誘導(dǎo)及增殖以無(wú)菌苗為外植體，將其剪成1.00~1.50 cm的莖段，接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基B1~B9中培養(yǎng)，1個(gè)月后統(tǒng)計(jì)叢生芽發(fā)生情況。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，考慮基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA等3個(gè)因素，3個(gè)水平·因素－1，選用L9（34）正交表的1，3和4列，共9種培養(yǎng)基。將樟樹叢生芽切割成3株·叢－1接種在增殖培養(yǎng)基C1~C5中，進(jìn)行叢生芽增殖試驗(yàn)，篩選出叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基。

1.2.4生根、練苗與移栽選擇具葉色翠綠、具光澤、薄革質(zhì)、完全展開(kāi)葉片的高度約3 cm單芽，接種在生根培養(yǎng)基D1~D8中。15 d后統(tǒng)計(jì)其生根情況。生根培養(yǎng)時(shí)所用基本培養(yǎng)基為1/2MS。當(dāng)植株的根系長(zhǎng)度大于5 cm時(shí)，可將組培苗置于大棚內(nèi)進(jìn)行練苗試驗(yàn)，設(shè)定0，5，10，15，20和25 d共6個(gè)時(shí)間段，各個(gè)時(shí)間段收集20瓶苗。待設(shè)定時(shí)間結(jié)束后，將植株從瓶?jī)?nèi)取出，用自來(lái)水清洗根部培養(yǎng)基，移栽至m（蛭石）∶m（泥炭）為1∶1的混合基質(zhì)中，統(tǒng)計(jì)其成活率。

1.2.5統(tǒng)計(jì)分析記錄與統(tǒng)計(jì)不同階段莖段產(chǎn)生的腋芽個(gè)數(shù)、叢生芽個(gè)數(shù)以及生根情況，其中正交試驗(yàn)結(jié)果采用SPSS統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行極差分析和方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1 6-BA和NAA對(duì)樟樹腋芽誘導(dǎo)的影響

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)配比對(duì)樟樹莖段的腋芽誘導(dǎo)與生長(zhǎng)情況統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表1。對(duì)照組A6在未添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)時(shí)，腋芽誘導(dǎo)率僅16.67%，外植體褐化率高達(dá)83.33%，顯著低于其他組合，表明添加NAA和6-BA對(duì)腋芽誘導(dǎo)有顯著影響；A1~A5處理的莖段隨6-BA質(zhì)量濃度和NAA質(zhì)量濃度的增加，誘導(dǎo)率均呈下降趨勢(shì)，以A2號(hào)即1.00 mg·L－16-BA + 0.01 mg·L－1NAA的誘導(dǎo)率最高，為90%；隨著NAA質(zhì)量濃度增加，畸形芽數(shù)和褐化率均有所增加，但芽的萌發(fā)個(gè)數(shù)并不完全隨著NAA的增加而減少，例如，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度為0.01~0.10 mg·L－1時(shí)，萌芽個(gè)數(shù)從63個(gè)增加到75個(gè)。綜合分析表明，樟樹腋芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋（0.01~0.10 mg·L－1）NAA。

表1　不同質(zhì)量濃度NAA和6-BA組合對(duì)樟樹腋芽誘導(dǎo)的影響Table 1 Effect of different combinations of NAA and 6-BA on inducing the axillary bud in Cinnamomum camphora

2.2樟樹叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基篩選

采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究基本培養(yǎng)基、6-BA和NAA對(duì)叢生芽誘導(dǎo)率的影響。9種處理組合獲得的叢生芽誘導(dǎo)率經(jīng)極差分析（表2）后表明，6-BA對(duì)樟樹叢生芽誘導(dǎo)的影響最顯著，R值高達(dá)105.13，其次為基本培養(yǎng)基，R值為63.47，而NAA的影響明顯小于前2個(gè)因素，R值僅為19.77。方差分析（表3）表明：不同基本培養(yǎng)基和6-BA對(duì)叢生芽誘導(dǎo)存在顯著差異，其顯著性值為P＜0.01，即2個(gè)因素對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響是極顯著的，而NAA對(duì)叢生芽形成存在顯著影響（P＝0.02），但未達(dá)極顯著水平。最小顯著差法（LSD）多重比較結(jié)果表明，叢生芽誘導(dǎo)的最適基本培養(yǎng)基為MS＞1/2MS＞B5，且三者間存在顯著差異；1.00 mg·L-16-BA對(duì)叢生芽誘導(dǎo)的影響最大，0.50 mg·L-16-BA影響次之，0.10 mg·L-16-BA影響最小，且三者之間存在極顯著差異；而0.10 mg·L-1NAA的影響最大，0 mg·L-1NAA影響次之，0.01 mg·L-1NAA影響最小，其中，0 mg·L－1和0.01 mg·L－1無(wú)顯著差異，而1.00 mg·L－1和其余2個(gè)質(zhì)量濃度之間存在顯著差異。綜合分析表明，樟樹叢生芽誘導(dǎo)率最佳培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋0.10 mg·L－1NAA。

表2　樟樹叢生芽誘導(dǎo)率極差分析Table 2 Range analysis for the induce of multiple shoots in C.camphora

表3　樟樹叢生芽誘導(dǎo)率方差分析Table 3 Variance analysis for the induce of multiple shoots in C.camphora

2.3 6-BA，NAA對(duì)樟樹叢生芽增殖的影響

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)的質(zhì)量濃度組合對(duì)樟樹叢生芽增殖的影響見(jiàn)表4。5種培養(yǎng)基都使叢生芽成活均在96%以上，但叢生芽的增殖系數(shù)差異很大。當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度在0.20~1.00 mg·L－1時(shí)，隨著6-BA質(zhì)量濃度升高，叢生芽的增殖系數(shù)顯著提高，當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度達(dá)到1.00 mg·L－1時(shí)，叢生芽增殖系數(shù)達(dá)到13.10，且芽苗生長(zhǎng)正常。叢生芽增殖對(duì)NAA比較敏感，當(dāng)NAA質(zhì)量濃度達(dá)到0.10 mg·L－1時(shí)，出現(xiàn)愈合組織和畸形芽；當(dāng)質(zhì)量濃度高達(dá)0.20 mg·L－1時(shí)愈合化嚴(yán)重，影響芽苗的正常生長(zhǎng)，且易形成畸形苗。因此，叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS＋（0.50~ 1.00 mg·L－1）6-BA。

表4　不同質(zhì)量濃度6-BA和NAA對(duì)叢生芽增殖的影響Table 4 Effect of the different combinations of NAA and 6-BA on the proliferation of multiple shoots

2.4 NAA和IBA對(duì)試管苗生根的影響

不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)濃度組合對(duì)樟樹試管苗生根的影響見(jiàn)表5。相同質(zhì)量濃度的NAA和IBA對(duì)試管苗生根的影響不同，NAA比IBA更好地促進(jìn)樟樹試管苗生根。D3組合即NAA為1.50 mg·L－1時(shí)生根率高達(dá)90%，平均根數(shù)為7.23根·株－1，達(dá)到實(shí)驗(yàn)組合中最高水平；隨著NAA質(zhì)量濃度升高，平均根長(zhǎng)變短，根變細(xì)且出現(xiàn)愈合化，D4組合即NAA質(zhì)量濃度達(dá)到2.0 mg·L－1時(shí)平均根長(zhǎng)僅3.11 cm，根細(xì)長(zhǎng)，不利于移栽后的成活；D3組合中根生長(zhǎng)狀況雖不如D1和D2組合，但其根長(zhǎng)（4.31 cm）與D2（4.59 cm）差異不大，且其生根率和平均根數(shù)都遠(yuǎn)高于其余組合。因此，認(rèn)為樟樹試管苗的最適生根培養(yǎng)基為1/2MS＋1.50 mg·L－1NAA。

表5　不同質(zhì)量濃度NAA和IBA對(duì)樟樹試管苗生根的影響Table 5 Effect of the different combinations of NAA and IBA on the rooting of test-tube plantlet

2.5練苗時(shí)間對(duì)試驗(yàn)苗移栽成活率的影響

研究不同的練苗時(shí)間對(duì)樟樹無(wú)菌苗成活率的影響見(jiàn)圖1。發(fā)現(xiàn)隨著練苗時(shí)間的增加，無(wú)菌苗移栽成活率呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)。其中，無(wú)菌苗的成活率最高時(shí)的練苗時(shí)間為15 d，成活率接近99.00%，隨著練苗時(shí)間繼續(xù)增加成活率開(kāi)始下降，練苗20 d時(shí)下降至97.32%，這說(shuō)明最佳的練苗時(shí)間應(yīng)在15~20 d之內(nèi)。練苗0 d或5 d時(shí)，植株的成活率均很低，不足60.00%，這說(shuō)明練苗時(shí)間對(duì)樟樹移栽成活率的影響較大，選擇合適的練苗時(shí)間能有效提高試驗(yàn)苗移栽的成活率。

圖1　練苗時(shí)間對(duì)試管苗成活率的影響Figure 1　Effect of the time for hardening-seedlings on the survival rate of the test-tube plantlet

3　小結(jié)與討論

本研究選取了具有優(yōu)良性狀的樟樹從腋芽誘導(dǎo)、叢生芽形成及增殖、試管苗生根到練苗移栽（圖2）4個(gè)方面進(jìn)行樟樹莖段組培快繁技術(shù)的研究，得到最適腋芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋（0.01~0.10 mg·L－1）NAA。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)分析得到叢生芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為MS＋1.00 mg·L－16-BA＋0.10 mg·L－1NAA而最佳增殖培養(yǎng)基則為MS＋（0.50~1.00 mg·L－1）6-BA。將無(wú)菌苗轉(zhuǎn)入最適生根培養(yǎng)基1/2MS＋1.50 mg·L－1NAA，生根率可達(dá)90%，然后將生根的無(wú)菌苗移栽至m（蛭石）∶m（泥炭）為1∶1的混合基質(zhì)中，經(jīng)過(guò)15~20 d練苗，95%以上無(wú)菌苗均能成活。

圖2　樟樹叢生芽組織培養(yǎng)快繁不同階段Figure 2 Different stages of mass propagation for multiple shoots in Cinnamomum camphora

6-BA和NAA是木本植物叢生芽快繁［10－13］中用途最廣、價(jià)格也較便宜的2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)。本研究即采用該2種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)進(jìn)行腋芽誘導(dǎo)、叢生芽誘導(dǎo)和增殖，力求得到樟樹叢生芽高效增殖培養(yǎng)基方案。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)6-BA對(duì)樟樹不定芽誘導(dǎo)具有突出的促進(jìn)作用，在一定范圍內(nèi)，產(chǎn)生的不定芽數(shù)量隨6-BA質(zhì)量濃度的增加而增加［4］，而NAA在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)可促進(jìn)叢生芽誘導(dǎo)，但因其易產(chǎn)生愈合組織而影響苗生長(zhǎng)，因此，在叢生芽誘導(dǎo)形成后可適量降低質(zhì)量濃度甚至去除NAA，更利于叢生芽增殖分化。本研究中在樟樹叢生芽增殖培養(yǎng)基中去除了NAA，其增殖系數(shù)可達(dá)到13.10，且芽苗生長(zhǎng)狀況良好無(wú)畸形芽出現(xiàn)。因此，在不同階段合理利用NAA是木本植物提高叢生芽誘導(dǎo)率和增殖系數(shù)的關(guān)鍵因素。移栽組培苗是樟樹組培的最后一個(gè)環(huán)節(jié)，也是關(guān)系成敗的重要環(huán)節(jié)之一，直接影響組培苗的生長(zhǎng)和成活率。研究發(fā)現(xiàn)練苗時(shí)間對(duì)樟樹組培苗移栽成活率的影響較大，未經(jīng)過(guò)練苗的成活率僅為32.81%，而經(jīng)過(guò)15~20 d則可達(dá)到97.00%以上，且移栽后的幼苗生命力旺盛，長(zhǎng)勢(shì)良好。所以提高叢生芽增殖系數(shù)和移栽成活率，能有效提高人工快繁效率，為樟樹優(yōu)良品種的產(chǎn)業(yè)化栽培提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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Tissue culture and rapid propagation for stems of Cinnamomum camphora

YE Runyan,TONG Zaikang,ZHANG Junhong,ZHU Yuqiu
（The Nurturing Station for the State Key Laboratory of Subtropical Silviculture,Zhejiang A &F University,Lin’an 311300,Zhejiang,China）

Abstract:To study the effect of naphthalene-acetic acid（NAA）and 6-benzylaminopurine 6-BA on the induction and multiplication of multiple shoots for Cinnamomum camphora during the process of primary culture and subculture,stems with axillary buds which sprouted at the beginning of spring were used as explants.To select the optimum medium for subculture,an orthogonal experiment was designed,and an extreme difference analysis and variance analysis（ANOVA）was used.Results showed that the optimal medium for inducing axillary buds was Murashige and Skoog（MS）+ 1.00 mg·L(－1)6-BA +（0.01－0.10 mg·L(－1)）NAA.The orthogonal experiment and ANOVA showed that the best medium for formation of multiple shoots was MS + 1.00 mg·L(－1)6-BA + 0.10 mg·L(－1)NAA,and the optimum medium for proliferation of multiple shoots was MS + 0.50－1.00 mg·L(－1)6-BA.After the aseptic seedling was transferred to the optimum rooting medium（1/2MS + 1.50 mg·L(－1)NAA）,the rooting rate reached above 90%.After 15－20 d of hardening,seedlings were transplanted to a mixed matrix with equal vermiculite and peat where the survival rate was greater than 95%.Thus,an efficient breeding technology for C.camphora was studied laying a technical foundation for industrialization of improved varieties.［Ch,2 fig.5 tab.13 ref.］

Key words:silviculture;Cinnamomum camphora;clustered shoots;asexual rapid propagation;tissue culture

作者簡(jiǎn)介：葉潤(rùn)燕，從事竹木育種研究。E-mail：yerunyan@126.com。通信作者：朱玉球，高級(jí)實(shí)驗(yàn)師，從事竹木育種研究。E-mail：yqzhu@zafu.edu.cn

基金項(xiàng)目：浙江省林木種苗產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目（2009R50035）；浙江省竹木育種重大專項(xiàng)（2012C12908-7）；浙江農(nóng)林大學(xué)研究生科研創(chuàng)新基金資助項(xiàng)目（3122013240236）

收稿日期：2015-01-29；修回日期：2015-06-04

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.01.024

中圖分類號(hào)：S723.1；Q945.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：2095-0756（2016）01-0177-06