杜義龍，潘海峰

(承德醫(yī)學院河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德　067000)

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HPLC法同時測定承德山里紅葉中綠原酸和牡荊素鼠李糖苷的含量

杜義龍，潘海峰

(承德醫(yī)學院河北省中藥研究與開發(fā)重點實驗室，河北 承德067000)

[摘要]目的：建立高效液相色譜(HPLC)法同時測定承德地區(qū)山里紅葉中綠原酸和牡荊素鼠李糖苷的含量。方法：采用AgiLent ZORBAX SB-C(18)色譜柱(4.6 mm×250 mm， 5 μm)；以乙腈-0.1%甲酸水溶液-四氫呋喃為流動相梯度洗脫；檢測波長為340 nm；檢測時間50 min；流速1.0 mL·min(-1)；柱溫30℃；進樣量10 μL。結果：15批承德山里紅葉樣品中綠原酸和牡荊素鼠李糖苷的線性范圍分別為2.56～410、2.51～400 mg·L(-1)(r分別為0.999 9，0.999 8)；平均加樣回收率分別為99.8% (RSD 0.48%)，99.7% (RSD 0.77%)。結論：該方法準確可靠，重現(xiàn)性好，可用于山里紅葉的質(zhì)量控制。

[關鍵詞]山里紅葉；高效液相色譜法；綠原酸；牡荊素鼠李糖苷

山里紅葉為薔薇科植物山里紅(Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.)的干燥葉，是山楂葉的一種，主產(chǎn)于河北承德、山東、山西和遼寧等地[1,2]。具有理氣通脈、活血化瘀、化濁降脂之功效[3]。2010版中國藥典在含量測定項下，采用HPLC法測定山楂葉中金絲桃苷的含量以控制山楂葉的質(zhì)量。近年來，本實驗室對山楂葉及其制劑進行了系統(tǒng)研究[4-7]，發(fā)現(xiàn)山楂葉化學成分復雜，主要含有牡荊素鼠李糖苷等黃酮類化合物和綠原酸等有機酸類化合物[8]，而金絲桃苷在山楂葉中含量較低，牡荊素鼠李糖苷和綠原酸在山楂葉中含量較高[5]，本文通過色譜條件的優(yōu)化，采用HPLC法同時測定山里紅葉中牡荊素鼠李糖苷和綠原酸的含量，以期為山楂葉質(zhì)量標準的提高提供理論依據(jù)。

1材料與試藥

1.1儀器

安捷倫1200系列液相色譜儀(G1322A 在線脫氣機、G1311A 二元泵、G1316A 柱溫箱、G1315D二極管陣列檢測器、G1329A自動進樣器)；安捷倫Chemstation色譜工作站；梅特勒-托利多1/10萬AG-245型電子分析天平，KQ-700型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功率700 W，頻率40 KHz)，HC-2062高速離心機(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)。

1.2試藥

對照品：綠原酸(中國藥品生物制品鑒定所，批號：110753-200413)、牡荊素鼠李糖苷(中國藥品生物制品鑒定所，批號： 111668-200602)對照品純度均大于99%；甲醇、乙腈、四氫呋喃均為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑為分析純。

藥材：山里紅葉由承德民族師范學院董建新教授鑒定為薔薇科山楂屬植物山里紅的干燥葉，藥材來源及采集時間見表1。

2方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)；流動相：A為0.1%甲酸水溶液，B為乙腈，C為四氫呋喃；梯度程序見表2；檢測波長340 nm；流速1.0 mL·min-1；柱溫30℃；進樣量10 μL。

表2　山里紅葉流動相梯度程序

2.2對照品溶液的制備

精密稱取牡荊素鼠李糖苷4 mg、綠原酸4.1 mg置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解定容，制成每1 mL含牡荊素鼠李糖苷0.4 mg、綠原酸0.41 mg的混合對照品溶液。混合對照品溶液色譜圖見圖1。

圖1　混合對照品溶液的HPLC色譜圖

2.3供試品溶液的制備

將去除雜質(zhì)的山里紅葉置于烘箱，60℃下干燥至恒重(約3 h)，用粉碎機粉碎；取山里紅葉粉末(過60目篩)約0.5 g，置具塞三角瓶中，加入70%的甲醇溶液25 mL，稱重；超聲提取30 min，冷卻至室溫，稱重，補足重量；過濾，續(xù)濾液過0.45 μm濾膜，即得。供試品溶液色譜圖見圖2、陰性對照溶液色譜圖見圖3。

圖2　供試品溶液的HPLC色譜圖

圖3　陰性對照溶液HPLC色譜圖

2.4含量測定

2.4.1線性關系考察以2.2中混合對照品溶液作為1號溶液，然后采用倍比稀釋法制成系列濃度的溶液，得2，3，4，5，6號混合對照品溶液。按照2.1項下色譜條件測定，記錄峰面積以對照品濃度為橫坐標、峰面積為縱坐標，進行線性回歸，結果綠原酸的回歸方程為Y=15 336X-15.491(r=0.999 9)，線性范圍為2.56～410 /mg·L-1；牡荊素鼠李糖苷的回歸方程為Y=15 404X-50.894(r=0.999 8)，線性范圍為2.51～400/mg·L-1。

2.4.2精密度試驗精密吸取同一藥材(S1)供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6次，記錄峰面積，結果綠原酸峰面積的RSD為0.5%，牡荊素鼠李糖苷峰面積的RSD為0.9%。

2.4.3重復性試驗取藥材粉末(S1) 6 份，按2.3項下方法操作制備供試品溶液，分別進樣，按2.1項下色譜條件測定，結果綠原酸含量的RSD 為1.2%，牡荊素鼠李糖苷含量的RSD 1.85% 。

2.4.4穩(wěn)定性試驗取同一藥材(S1)，按2.3項下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，24 h進樣，按2.1項下色譜條件測定，結果綠原酸峰面積的RSD為0.8%，牡荊素鼠李糖苷峰面積的RSD為1.0%，表明供試品在24 h內(nèi)測試穩(wěn)定。

2.4.5加樣回收率試驗精密稱定已知綠原酸和牡荊素鼠李糖苷含量的同一批山里紅葉藥材(S1) 6份，每份約0.25 g，分別加入2種對照品適量，按2.3項方法制備供試品溶液，按2.1項色譜條件測定峰面積，由回歸方程計算樣品中綠原酸和牡荊素鼠李糖苷的含量，回收率的測得量見表3。

表3　2種成分的回收率測定結果

2.4.6含量測定分別精密稱量15批藥材各0.5 g，按2.3項下制備供試品溶液，按2.1色譜條件進行測定，每份樣品平行測定3次，依次測定各批樣品，計算各指標成分含量，見表4。

表4　山里紅葉2種成分的含量(n=3)

3討論

3.1提取條件的優(yōu)選

本研究分別考察了提取方法、溶劑種類和提取時間對山里紅葉提取效果的影響。3種提取方法中, 索氏提取和回流提取溶劑消耗量較大,提取時間較長。而相比之下超聲提取操作簡單且提取充分。通過實驗發(fā)現(xiàn)，70%甲醇超聲提取30 min，提取效果較好，縮短提取時間提取不充分，延長提取時間，對提取效果無明顯改變。

3.2色譜條件的優(yōu)化

在前期研究的基礎上，本文進一步優(yōu)化色譜條件，最終采用本文的色譜條件，在分離度不受影響的基礎上，簡化了流動相體系，固定了檢測波長，大大縮短了檢測時間，提高了檢測的效率。

本文對 15 批山里紅葉樣品同時進行牡荊素鼠李糖苷和綠原酸的含量測定， 不同批次間2個成分的含量相差較大，這有可能是不同產(chǎn)地的藥材種植不規(guī)范造成的，所以加強中藥種植生產(chǎn)的全方位管理對提高中藥質(zhì)量具有重要意義。

[參考文獻]

[1]陳忠,盧樹杰,張維庫,等.HPLC測定山楂葉總黃酮中牡荊素鼠李糖苷含量[J].中成藥,2009,31(10):1615.

[2]郝近大.實用中藥材經(jīng)驗鑒定[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,2001.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2010.

[4]王領弟,李艷榮,張曉峰,等.山楂葉指紋圖譜研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011,17 (19):74-77.

[5]杜義龍,李艷榮,張曉峰,等.承德產(chǎn)山楂葉的HPLC指紋圖譜研究[J].中國現(xiàn)代應用藥學，2012,29(10):906-910.

[6]潘海峰,王領弟,李艷榮,等.HPLC法同時測定山玫膠囊中8個成分的含量[J].藥物分析雜志，2012,32(11):1962-1967.

[7]王肖,杜義龍,趙勝男,等.承德產(chǎn)山楂葉中總黃酮和5 種黃酮類成分含量的動態(tài)分析[J].中國實驗方劑學雜志，2013,19(17):171-175.

[8]劉榮華,余伯陽.山里紅葉化學成分研究[J].中藥材,2006,29(11):1169-1173.

本文編輯：王知平

Determination of ChLorogenic Acid and Vitexin Rhamnoside in Major Hawthorn Leaf of Chengde by HPLC

DU Yilong，PAN Haifeng

(ChengdeMedicalCollege,TraditonalChineseMedicineResearchandDevelopmentLab.inHebei,Chengde067000，Hebei,China)

[ABSTRACT]Objective: To develop HPLC method for simultaneous determination of chlorogenic acid and vitexin rhamnoside in Major Hawthorn Leaf of Chengde.Method: With an Agilent ZORBAX SB-C(18) column(4.6 ×250 mm,5 μm), gradient elution was performed by mobile phase of 0.1% formic acid-acetonitrile -tetrahydrofuran.The detection wavelength was 340 nm;detection time was 50 min; fLow rate was 1.0 mL·min(-1); the column temperature was 30℃; injection volume was 10 μL.Results: In the 15 batches of Major Hawthorn Leaf of chengde, the Linear ranges of chlorogenic acid and vitexin rhamnoside were from 2.56～410 mg·L (-1) (r=0.999 9) to 2.51～400 mg·L(-1) (r=0.999 8), respectively.The average recovery rates of chlorogenic acid and vitexin rhamnoside were 99.8% (RSD 0.48%),99.7%(RSD0.77%),respectively.Conclusion: This method is accurate, reproducible and suitable for controlling the quality of Major Hawthorn Leaf.

[KEYWORDS]Major Hawthorn Leaf; High-performance Liquid Chromatography; Chlorogenic Acid; Vitexin Rhamnoside

[中圖分類號]R917

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-0126(2016)01-0004-04

[作者簡介]杜義龍，男，助教，從事中藥質(zhì)量標準研究工作