陳海霞　黃廣麗　周紅瀛　石慶生

?

人參皂苷Rg1減輕大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的作用研究

陳海霞黃廣麗周紅瀛石慶生

【摘要】目的探討人參皂苷Rg1對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的減輕作用及機制。方法制備大鼠離體心臟I/R模型，將18只大鼠隨機分為正常對照組、I/R組、人參皂苷Rg1組。100 μmol/L人參皂苷Rg1進行預(yù)處理10 min，觀察血流動力學(xué)指標左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率和心率壓力乘積的變化，檢測灌流液中肌酸激酶(CK)、乳酸脫氫酶(LDH)活性。Western blotting檢測心肌組織PI3K下游激酶Akt、ERK1/2及其磷酸化水平的變化，磷酸化GSK-3β的蛋白表達。結(jié)果與I/R組比較，人參皂苷Rg1預(yù)處理顯著改善心臟功能，降低灌流液中CK、LDH活性(P＜0.05) ;升高p-Akt和p-GSK-3β的蛋白表達(P＜0.05)。結(jié)論人參皂苷Rg1對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷有減輕作用，其機制與激活PI3K-Akt通路有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】人參皂苷Rg1;大鼠離體心臟;血流動力學(xué)指標;肌酸激酶;乳酸脫氫酶

近年來，病毒性心肌炎、心肌梗死發(fā)病率逐年升高，現(xiàn)已成為目前常見的心血管疾病。病毒感染可引起心肌細胞的變性和壞死，繼發(fā)免疫損傷，同時心肌纖維連接蛋白合成增加，降解減少，成纖維細胞產(chǎn)生細胞外基質(zhì)，最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化。研究表明，人參有心肌保護作用，人參皂苷為其主要藥效成分，人參皂苷Rg1是人參皂苷的重要組分，能顯著改善心肌缺血狀態(tài)，減少缺血再灌注心肌細胞凋亡，改善心肌的舒縮功能，對心肌炎癥或缺血等損傷有明顯的保護作用［1］。本研究探討人參皂苷Rg1對大鼠離體心臟缺血再灌注損傷的減輕作用及機制，報道如下。

1　材料與方法

1.1實驗動物健康雄性SD大鼠，18只，體重300～ 340 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，合格證編號: SCXK(京) 2009-0004。

1.2主要試劑與儀器

1.2.1藥物與試劑:人參皂苷Rg1對照品，天津一方科技有限公司，純度＞98%，Rg1分子量801.01，6.25、25、100 μmol/L相當于0.005、0.02、0.08 mg/ml。CK、LDH試劑盒，中生北控生物科技股份有限公司;蛋白裂解液、GAPDH抗體，Saierbio Technology Incorporation; PKB/Akt、p-PKB/Akt(Ser-473)、ERK1/2、p-ERK1/2、GSK-3β、p-GSK-3β(Ser-9)抗體，Cell Signaling Technology，Inc。Krebs-Henseleit(K-H)緩沖液(mmol/L)配制: NaCl 118、NaHCO324.0、KCl 4.7、MgSO41.2、KH2PO41.2、Glucose 11.1、CaCl22.5，pH值7.2～7.4。

1.2.2實驗儀器: Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)，澳大利亞ADInstrument Pty Ltd;日立7020全自動生化分析儀，日本HITACHI公司; ORION 8102BNUWP型PH計，美國Thermo公司; miliq INTERGRD5超純水系統(tǒng)，美國millipore; UC750超聲波破碎儀，美國SONICS公司;蛋白電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)、proteanplus multi-ge多板制膠機，BIO-RAD。

1.3實驗方法

1.3.1大鼠離體心臟的制備:麻醉大鼠后，迅速開胸取心臟置于預(yù)冷的K-H緩沖液中，主動脈固定于一插管上，后懸掛于Langendorff心臟灌流裝置，用K-H緩沖液以65 mm Hg恒壓逆行灌流。37℃恒溫保存灌流液及心臟，將頭端帶有含水球囊的導(dǎo)管經(jīng)二尖瓣口插入左心室，導(dǎo)管另一端連接壓力感受器，實時監(jiān)測并計算心臟功能參數(shù)。

1.3.2實驗分組及流程:按體重隨機區(qū)組法將大鼠分為3組，每組6只，采用全心停灌再灌注的方法建立離體心臟缺血再灌注模型，全心停灌40 min，復(fù)灌60 min以評價血流動力學(xué)、酶學(xué)指標(CK、LDH)。實驗分組如下:①正常對照組(control組) :心臟用K-H緩沖液持續(xù)灌流130 min (血流動力學(xué)、TTC染色等)或80 min(Western blotting檢測)。②I/R組:心臟平衡30 min后，全心停止灌流40 min，復(fù)灌60 min作為缺血再灌注對照組，即I/R組。③人參皂苷Rg1 (100 μmol/L)組(IR+ Rg1組) :心臟平衡20 min后，用含終濃度100 μmol/L人參皂苷Rg1(劑量參考相關(guān)文獻［1，2］)的K-H緩沖液灌流心臟10 min，K-H緩沖液灌流沖洗后，全心停止灌流40 min，復(fù)灌60 min。全心停灌40 min，復(fù)灌10 min，用以Western blotting檢測。停止灌流期間，心臟用37℃K-H緩沖液恒溫浸泡。

1.3.3心臟功能的測定:全程監(jiān)測離體心臟血流動力學(xué)參數(shù)。LVDP=LVSP-LVEDP; RPP=LVDP * HR;［RPP、±dp/dtmax］恢復(fù)率(%)=某時間點［RPP、±dp/dtmax］值×100%/基礎(chǔ)水平［RPP、±dp/dtmax］值。

1.3.4心臟流出液CK、LDH活性的測定:分別在心臟灌注平衡20 min，再灌注10、20、30、60 min收集冠脈流出液，即時用全自動生化分析儀及相應(yīng)試劑盒測定CK、LDH活性。

1.3.5Western blotting檢測心肌組織蛋白表達:將心肌組織剪碎研磨，加細胞裂解液，低溫離心取上清液。100 ml/L聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，將蛋白電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。滴加含50 g/L脫脂乳的TBST封閉緩沖液中封閉后，依次滴加相應(yīng)抗體，4℃孵育過夜，加相應(yīng)二抗，37℃孵育2 h，顯色后底片行數(shù)碼拍攝，并用ImageJ 1.37軟件進行半定量灰度分析。

2　結(jié)果

2.1人參皂苷Rg1對I/R大鼠離體心臟血流動力學(xué)的影響

2.1.1心率壓力乘積RPP的恢復(fù)率:心率壓力乘積RPP是反映心臟收縮功能的重要指標，大鼠心臟40 min缺血后，再灌注RPP恢復(fù)最高點及60 min時，I/R組RPP恢復(fù)率顯著降低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。再灌注RPP恢復(fù)最高點及60 min時，人參皂苷Rg1組RPP恢復(fù)率顯著升高，與I/R組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，表明100 μmol/L人參皂苷Rg1能顯著改善缺血再灌注造成的心臟收縮功能降低。見表1。

表1　人參皂苷Rg1對I/R大鼠離體心臟RPP恢復(fù)率的影響n=6，±s

表1　人參皂苷Rg1對I/R大鼠離體心臟RPP恢復(fù)率的影響n=6，±s

注:與control組比較，*P＜0.01;與I/R組比較，#P＜0.05; RPP的恢復(fù)率(%，該時間點RPP×100%/給藥前RPP值)

組別　劑量(μmol/L) RPP恢復(fù)率(%) Peak value　60 min control組?。?7.6±15.5　74.1±12.5 I/R組?。?4.05±6.92*　6.85±3.66*I/R+ Rg1組　100　49.89±27.19#　26.12±15.76#

2.1.2左心室內(nèi)壓最大上升速率(+ dp/dtmax)、左心室內(nèi)壓最大下降速率(－dp/dtmax)大鼠心臟缺血40 min后，再灌注+ dp/dt或－dp/dt恢復(fù)最高點及60 min時，I/R組左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率恢復(fù)率顯著降低，與正常對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。再灌注+ dp/dt或－dp/dt恢復(fù)最高點及60 min時，人參皂苷Rg1組左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率及其變化率均顯著升高，與I/R組比較，有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05)。見表2。

表2　人參皂苷Rg1對I/R大鼠+ dp/dt、－dp/dt恢復(fù)率的影響n=6，±s

表2　人參皂苷Rg1對I/R大鼠+ dp/dt、－dp/dt恢復(fù)率的影響n=6，±s

注:與control組比較，*P＜0.01;與I/R組比較，#P＜0.05; RPP的恢復(fù)率(%) :該時間點RPP×100%/給藥前RPP值

組別　劑量(μmol/L)+ dp/dt恢復(fù)率(%) Peak value　60 min －dp/dt恢復(fù)率(%) Peak value　60 min control組?。?9.0±10.0　86.0±8.3　89.5±13.7　82.8±13.3 I/R組?。?0.93±7.85*　6.30±4.35* 17.14±9.99*　9.90±5.63* I/R+ Rg1組　100　21.66±3.46#　20.64±2.87# 55.62±31.65# 35.56±29.49#

2.2人參皂苷Rg1對I/R大鼠離體心臟冠脈流出液中CK、LDH的影響再灌注10、30、60 min時，100 μmol/L人參皂苷Rg1組CK、LDH釋放量比I/R組著降低(P＜0.05)。見表3、4。

2.3離體心臟心肌組織Akt、ERK1/2、GSK-3β及其磷酸化的蛋白表達Western blotting結(jié)果顯示，各組Akt、ERK1/2、GSK-3β蛋白表達無顯著差異(數(shù)據(jù)未列出)。與control組比較，I/R組p-Akt(Ser-473)/Akt升高;人參皂苷Rg1預(yù)處理后p-Akt(Ser-473)/Akt顯著升高，與I/R組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，提示人參皂苷Rg1能上調(diào)p-Akt蛋白表達。人參皂苷Rg1預(yù)處理后，p-GSK-3β(Ser-9)/GSK-3β比I/R組升高，提示人參皂苷Rg1能上調(diào)p-GSK-3β蛋白表達。見表5，圖1。

表3　人參皂苷Rg1對IR大鼠LDH釋放的影響n=6，U/L±s

表3　人參皂苷Rg1對IR大鼠LDH釋放的影響n=6，U/L±s

注:與I/R組比較，*P＜0.05

組別　劑量(μmol/L)釋放10 min　30 min　60 min I/R組　－　87.07±29.58　78.86±24.49　79.92±25.46 I/R+ Rg1組　100　48.09±22.08*47.18±21.06*59.96±21.51*

表4　人參皂苷Rg1對IR大鼠CK釋放的影響n=6，U/L±s

表4　人參皂苷Rg1對IR大鼠CK釋放的影響n=6，U/L±s

注:與I/R組比較，*P＜0.05

組別　劑量(μmol/L)釋放10 min　30 min　60 min I/R組?。?88.21±15.58 265.69±17.93 271.39±13.08 I/R+ Rg1組　100　191.57±8.67*220.03±4.03*239.65±19.38

表5　大鼠離體心臟p-Akt(Ser-473)/Akt、p-GSK-3β(Ser-9)/GSK-3β、p-ERK1/2/ERK1/2表達　n=3，±s

表5　大鼠離體心臟p-Akt(Ser-473)/Akt、p-GSK-3β(Ser-9)/GSK-3β、p-ERK1/2/ERK1/2表達　n=3，±s

注:與control組比較，*P＜0.01;與I/R組比較，#P＜0.05

組別　p-Akt/Akt　p-GSK-3β/GSK-3βp-ERK1/2/ERK1/2 control組0.13±0.04　0.13±0.03　0.09±0.02 I/R組　0.66±0.14*　1.08±0.22*　0.10±0.02 Rg1組　1.23±0.32#　1.96±0.61#0.10±0.03

圖1　離體大鼠心臟Akt、GSK-3β、ERK1/2及其磷酸化的蛋白表達

1、5: control組;2、6: I/R組; 3、7:人參皂苷Rb1 100 μmol/L組(與本實驗無關(guān)) ;4、8:人參皂苷Rg1 100 μmol/L組

3　討論

心肌缺血再灌注損傷由Jennings于1960年第一次提出，是指細胞因缺血發(fā)生可逆性的損傷，在缺血糾正后，這種損傷反而更加嚴重，繼而引起細胞死亡或進一步的功能障礙。近年來，隨著冠狀動脈再通治療，如溶栓療法、經(jīng)皮冠脈介入療法、冠狀動脈旁路搭橋術(shù)及心臟移植術(shù)的廣泛應(yīng)用于臨床，其嚴重的并發(fā)癥—心肌缺血再灌注損傷(MIRI)的防治日益受到重視。

人參皂苷Rg1是人參中提取的皂苷類有效成分之一，具有抗心肌缺血再灌注損傷作用。Zhu等［3］研究表明，在缺氧/復(fù)氧刺激的大鼠心肌細胞，人參皂苷Rg1通過增加超氧化物歧化酶，減少活性氧及抑制細胞內(nèi)Ca2+超載，發(fā)揮抗氧化及維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)作用。Wei等［4］研究顯示，人參皂苷Rg1可穩(wěn)促大鼠心室微血管生成，恢復(fù)灌注后梗死區(qū)域的心肌功能。張慶勇等［5］研究證明，人參皂苷Rg1通過減小大鼠心肌梗死面積、增加梗死區(qū)邊緣的微血管密度及心肌組織內(nèi)一氧化氮水平達到治療效果。Wang等［6］研究顯示，人參皂苷Rg1使心肌梗死家兔局部心肌組織中的粒細胞集落刺激因子誘導(dǎo)骨髓外周血單個核細胞遷移至心肌組織，使血管內(nèi)皮細胞進一步分化，血管內(nèi)皮細胞的再生促進梗死心肌組織毛細血管再生以恢復(fù)血液供應(yīng)。研究表明，人參皂苷Rg1可通過PI3K/Akt信號通路上調(diào)HIF-1α及其下游基因VEGF在人臍靜脈內(nèi)皮細胞中的表達以促進血管新生［7，8］。

PI3K-Akt途徑是正常細胞內(nèi)存在的細胞生存激酶信號系統(tǒng)，當細胞發(fā)生MIRI時，其被激活而抑制細胞的凋亡，稱為再灌注損傷補救激酶，它在心肌再灌注損傷中起著極為重要的保護作用［9］。文獻報道，人參皂苷類成分其發(fā)揮心肌保護作用的機制主要通過激活PI3K/Akt-eNOS級聯(lián)和ERK1/2信號傳導(dǎo)通路(即RISK通路)，促進血管內(nèi)皮細胞產(chǎn)生NO，擴張冠脈血管，增加冠脈血流，發(fā)揮心肌保護作用［10，11］。但人參皂苷Rg1能否在動物離體心臟發(fā)揮抗心肌缺血再灌注作用及是否與激活PI3K-Akt和ERK1/2信號通路有關(guān)尚未見報道。

本研究制備大鼠Langendorff離體心臟缺血再灌注損傷模型，應(yīng)用100 μmol/L人參皂苷Rg1進行預(yù)處理，發(fā)現(xiàn)人參皂苷Rg1能改善心臟血流動力學(xué)，如RPP恢復(fù)率、左心室內(nèi)壓最大上升速率恢復(fù)率、左心室內(nèi)壓最大下降速率恢復(fù)率;降低心臟灌流液中CK、LDH。人參皂苷Rg1上調(diào)心肌p-Akt、p-GSK-3β(Ser-9)蛋白表達，提示激活PI3K-Akt信號通路在人參皂苷Rg1的心肌保護中發(fā)揮了重要作用。

參考文獻

1 Li W，Chu Y，Zhang L，et al.Ginsenoside Rg1 attenuates tau phosphorylation in SK-N-SH induced by Aβ-stimulated THP-1 supernatant and the involvement of p38 pathway activation.Life Sci，2012，91:809.

2 Li W，Chu Y，Zhang L，et al.Ginsenoside Rg1 prevents SK-N-SH neuroblastoma cell apoptosis induced by supernatant from Aβ1-40-stimulated THP-1 monocytes.Brain Res Bull，2012，88:501.

3 Zhu D，Wu L，Li CR，et al.Ginsenoside Rg1 protects rat cardiomyocyte from hypoxia/reoxygenation oxidative injury via antioxidant and intracellular calcium homeostasis.Cell Biochem，2009，108:117-124.

4 Wei HJ，Yang HH，Chen CH，et al.Gelatinmicrospheres encapsulated with a nonpeptide angiogenic agent，ginsenoside Rg1，for intramyocardial injection in a rat model with infarcted myocardium.Control Release，2007，120: 27-34.

5 張慶勇，陳燕萍，劉芬，等.人參皂苷Rg1對大鼠急性缺血心肌血管再生的促進作用.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2013，35: 42-45.

6 Wang NY，Lu CJ，Chen XH.Study on effect of ginsenoside Rg1 in promoting myocardiac vascular endothelial cell regeneration through induc-tion on bone marrow stem cell’s migration and differentiation in rabbits of myocardial infarction.Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi，2005，25: 916-919.

7 盧瓊，譚睿，崔文婷，等.細胞信號通路與動脈粥樣硬化.中國醫(yī)藥生物技術(shù)，2012，7:211-215.

8 Yin H，Liu Z，Li F，et al.Ginsenoside-Rg1 enhances angiogenesis and meliorates ventricular remodeling in a rat model of myocardial infarction.Mol Med (Berl)，2011，89:363-375.

9 Hauseuloy DJ，Tsang A，Yellon DM，et al.The reperfusion injury salvage kinase pathway: A common target for both ischemic preconditioning and postconditioning.Trends Cardiovasc Med，2005，15:69-75.

10 Zhou H，Hou SZ，Luo P，et al.Ginseng protects rodent hearts from acute myocardial ischemia-reperfusion injury through GR/ER-activated RISK pathway in an endothelial NOS-dependent mechanism.J Ethnopharmacol，2011，135:287-298.

11 Leung KW，Cheng YK，Mak NK，et al.Signaling pathway of ginsenoside-Rg1 leading to nitric oxide production in endothelial cells.FEBS Lett，2006，580: 3211-3216.

·論著·

Cardioprotection effects of Ginsenoside Rg1 on ischemia/reperfusion injury in isolated hearts of rats

CHEN Haixia，HUANG Guangli，ZHOU Hongying，et al.
Department of Pediatrics，Handan Hospital for Maternal and Child Health，Hebei，Handan 056001，China

【Abstract】ObjectiveTo investigate cardioprotection effects of Ginsenoside Rg1 on ischemia/reperfusion(I/R) injury in isolated hearts of rats，and to explore its action mechanism.Methods The Langendorff models of myocardial I/R injury in rats were established.The 18 rats were randomly divided into three groups: control group，I/R group and Ginsenoside Rg1 group，with 6 rats in each group.The rats’hearts in Ginsenoside Rg1 group were pretreated with Ginsenoside Rg1 100μmol/L for 10min.The cardiac indexes including maximal rise/fall of left ventricular pressure (±dp/dtmax) and rate pressure product (RPP) were measured，and the activities of creatine kinase (CK) and lactate dehydrogenase (LDH) were detected.The changes of phosphorylation of protein kinase B/Akt，and its downstream target glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) and extracellular signal-regulated kinase1/2 (ERK1/2) were detected after 10－minute reperfusion.Results As compared with those in I/R group，the activities of CK，LDH in Ginsenoside Rg1 group were significantly decreased and cardiac function was obviously improved (P＜0.05)，moreover，the expression levels of p-Akt and p-GSK-3βwere significantly increased (P＜0.05).ConclusionGinsenoside Rg1 can alleviate I/R injury in isolated hearts of rats，and its action mechanism may be correlated to the activation of PI3K-Akt signaling pathway.

【Key words】Ginsenoside Rg1; isolated rat hearts; hemodynamic parameters; creatine kinase; lactate dehydrogenase

(收稿日期:2015－09－09)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.04.001

【中圖分類號】R 972

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386(2016) 04－0485－04

作者單位: 056001河北省邯鄲市婦幼保健院