王永棟　張飛　王瑩　連子亮　李躍晨

?

CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽性肝硬化患者對肝功能的影響研究

王永棟張飛王瑩連子亮李躍晨

【摘要】目的研究與觀察CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽性肝硬化患者對其肝功能的影響。方法收治60例慢性HBV DNA陽性肝硬化患者，并給予輸注CIK細(xì)胞治療。于治療前采集患者外周血，分離并培養(yǎng)、擴增CIK細(xì)胞，最后將提純成功的細(xì)胞制成CIK制劑，通過靜脈輸液的方式回輸至患者體內(nèi)。結(jié)果CIK細(xì)胞可抑制乙肝病毒DNA復(fù)制，患者肝功能較治療前好轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)陰率達到13.33%，應(yīng)答總有效率為63.33%;患者并發(fā)癥較少，程度輕。結(jié)論CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽性肝硬化效果明顯，應(yīng)在臨床推廣和應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】CIK細(xì)胞;慢性HBV; DNA;陽性;肝硬化

肝癌是我國城鄉(xiāng)居民高發(fā)的惡性消化道腫瘤之一，誘發(fā)因素多樣，其主要致病因素可分為病毒感染、黃曲霉素感染、酒精、肝硬化和亞硝酸鹽類物質(zhì)等［1］。其中，病毒感染和肝硬化占據(jù)肝癌病因的首位。肝炎病毒感染后可進一步發(fā)展為慢性肝硬化，故研究肝炎病毒感染患者的治療方案對進一步治療肝硬化及預(yù)防肝癌有重要意義。患者因各種意外感染肝炎病毒后，若沒有得到合理的治療，可發(fā)展成為病毒性肝炎。目前臨床中常見的肝炎病毒可分為:甲型、乙型、丙型、丁型和戊型。其中，乙型肝炎病毒(HBV)在五類肝炎病毒中的發(fā)病率最高，乙型肝炎在世界范圍內(nèi)均有流行，對患者身體造成的損傷程度較重，危害性大。據(jù)相關(guān)醫(yī)學(xué)資料報道，至2014年，乙肝表面抗原陽性的乙肝病毒感染者已達到全球人口的16%。我國是乙型肝炎的高發(fā)區(qū)，城鄉(xiāng)乙型肝炎病毒感染者超過總?cè)丝诘?5%～35%，而慢性病毒攜帶者的發(fā)病率則高達10%［2］。據(jù)不完全統(tǒng)計，在我國有超過4000萬的慢性乙肝患者，而其中的小部分患者會在數(shù)年至數(shù)十年內(nèi)發(fā)展成為病毒性肝硬化或肝癌。由于多數(shù)病毒感染者會在感染后的一定時間內(nèi)經(jīng)歷以下各個時期:肝炎病毒感染-病毒性肝炎-肝硬化-肝癌，每年因病毒性肝炎進展為肝癌最后導(dǎo)致死亡的患者可達到40萬［3］。因此，如何科學(xué)、合理地治療乙型肝炎陽性肝硬化患者成為我院科研人員研究的重要任務(wù)。

1　資料與方法

1.1一般資料我院在2014年1月至2014年7月期間收治了60例慢性HBV DNA陽性肝硬化患者，男36例，平均年齡(51.4±1.5)歲，病程6個月～3.6年;女24例，平均年齡(48.1±2.3)歲;病程8個月～5.2年。60例患者在此次治療前曾接受藥物治療，現(xiàn)因病情不緩解、加重，特來我院繼續(xù)支持治療。

1.2實驗方法細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷(cytokine-induced killer，CIK)細(xì)胞的獲取與擴增:收集患者外周血，稀釋分離，淋巴細(xì)胞，獲取單個核細(xì)胞;將細(xì)胞懸浮于無血清培養(yǎng)液的上層，加入細(xì)胞因子IFN-γ 2 000 U/ml。在培養(yǎng)后的第72～96小時內(nèi)，往培養(yǎng)瓶中添加30 ml無血清培養(yǎng)液，同時加入細(xì)胞因子IL-2 1 000 U/ml。在培養(yǎng)后的1～2周內(nèi)觀察培養(yǎng)液顏色變化，適當(dāng)添加無血清培養(yǎng)液，并加入細(xì)胞因子IL-2 1 000 U/ml。在培養(yǎng)后期，檢測培養(yǎng)液有無真菌污染。最后制成CIK細(xì)胞懸濁液，靜脈輸入患者體內(nèi)。

1.3評價指標(biāo)不良反應(yīng)，血液生化和血常規(guī)指標(biāo)，轉(zhuǎn)陰率。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗，計量資料以±s表示，組間比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1不良反應(yīng)患者在輸入CIK細(xì)胞后24～96 h內(nèi)出現(xiàn)一過性的體溫升高，肌肉酸痛、全身乏力、惡心嘔吐等不良反應(yīng)，但程度較輕，持續(xù)時間短，患者可耐受，不需藥物治療。各并發(fā)癥發(fā)生率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表1。

表1　慢性HBV DNA陽性肝硬化患者經(jīng)CIK細(xì)胞治療后并發(fā)癥情況n=60，例

2.2血液生化和血常規(guī)指標(biāo)治療結(jié)束后，相關(guān)血液生物指標(biāo)顯示多數(shù)患者肝臟功能較治療前好轉(zhuǎn)。見表2。

表2　慢性HBV DNA陽性肝硬化患者經(jīng)CIK細(xì)胞治療前、后血液生化和血常規(guī)指標(biāo)對比　n=60，±s

表2　慢性HBV DNA陽性肝硬化患者經(jīng)CIK細(xì)胞治療前、后血液生化和血常規(guī)指標(biāo)對比　n=60，±s

指標(biāo)　治療前　治療后ALT(U)81.8±51.8　49.3±38.1 ALB(g)　33.7±6.1　39.6±5.1 TP(g)　66.7±3.6　73.6±5.5 GLO(g)　28.4±4.7　32.9±5.1 TBIL(μmol)　23.1±12.5　17.4±10.9 PLT(×109/L)　115.7±79.4　123.5±80.3 WBC(×109/L)5.5±1.3　5.8±1.2

2.3轉(zhuǎn)陰率治療后，患者應(yīng)答總有效率為76.67%，15例為完全應(yīng)答，31例為部分應(yīng)答; 8例患者體內(nèi)監(jiān)測不到HBV-DNA，轉(zhuǎn)陰率達到13.33%。

3　討論

在少數(shù)民族中，藏族人群的肝炎發(fā)病率最高，約為整體水平的26%，維族人群的發(fā)病率則低至3%，而漢族人群的發(fā)病率約為12%，處于中間水平［4］。乙型肝炎的發(fā)生還與家族聚集性有關(guān)，家族中的成員感染病毒后，其后代和家庭中的其他成員乙型肝炎發(fā)病率也隨之提高。經(jīng)過調(diào)查后發(fā)現(xiàn)，該現(xiàn)象與家族中的成員同感染者密切接觸、擁有相同的飲食習(xí)慣有關(guān)。

人體感染乙肝病毒后，由于個體間的綜合情況存在差異，患者間的發(fā)病情況也有所不同。目前醫(yī)學(xué)界中乙肝感染后的發(fā)病類型可分為以下3種: (1)患者身體素質(zhì)較好，免疫系統(tǒng)完善，抗病毒能力較強，免疫細(xì)胞被病毒激活后識別乙肝表面抗原，攻擊、吞噬、清除已成為病毒宿主的肝細(xì)胞，身體出現(xiàn)一系列的急性炎性反應(yīng)，為急性乙肝。(2)患者免疫機能處于較低水平，能夠被病毒激活，攻擊被感染的細(xì)胞，但無力把細(xì)胞徹底清除出體外，導(dǎo)致后續(xù)反復(fù)的感染、壞死、修復(fù)、增生等一系列的慢性炎性反應(yīng)，為慢性乙肝［5］。(3)人體免疫細(xì)胞不識別乙型肝炎病毒的抗原，病毒在體內(nèi)不受到免疫攻擊，與人體共存，無任何表現(xiàn)，為病毒攜帶者［6］。

由于我國肝炎發(fā)病率較高，每年因肝炎致死的患者不少于40萬，故肝炎后肝硬化的治療成為各界醫(yī)學(xué)人員的共同研究課題。目前，臨床中乙型肝炎的治療方針主要有抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、保肝護肝、抗纖維化等。其中，最為重要的為抗病毒治療，通過抑制病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制達到抑制病毒繁殖的目的［7］。而自20世紀(jì)抗病毒藥物發(fā)明以來，人類對抗病毒藥物的認(rèn)識和應(yīng)用又有了進一步的認(rèn)識。過繼免疫治療是以往治療的常用方案之一，將特異免疫性細(xì)胞或含有特異免疫功能的細(xì)胞產(chǎn)物在體外進行加工，之后輸注到患者體內(nèi)，提高患者的免疫功能。然而由于科技條件的限制，目前尚無較好的方式提煉出含量較高、活力較好的效應(yīng)細(xì)胞。CIK細(xì)胞是國內(nèi)外用于過繼免疫治療的主力軍，在人體內(nèi)含量較少，在外周血中的含量不足10%，主要經(jīng)體外的生物擴增技術(shù)得到，屬于T淋巴細(xì)胞。該細(xì)胞用于免疫治療的機制在于可分泌包括白細(xì)胞介素等炎性介質(zhì)在內(nèi)的多種細(xì)胞因子，這些細(xì)胞因子在體內(nèi)可激活人體的免疫系統(tǒng)，從而達到免疫發(fā)揮的效果［8］。為了進一步了解和認(rèn)識CIK細(xì)胞治療乙型肝炎的效果，我國醫(yī)學(xué)人員對CIK細(xì)胞的作用機制、臨床療效和安全性做了深入的探究和臨床試驗。用特異性的抗原刺激CIK細(xì)胞可使其加速成熟，縮短反應(yīng)時間。并且經(jīng)過臨床人員的觀察，乙肝表面抗原刺激后的CIK細(xì)胞對健康人和乙肝病毒感染者均有較好的治療效果，其病毒殺傷力、清除率高于單純未經(jīng)致敏的CIK細(xì)胞。有學(xué)者研究利用致敏的CIK細(xì)胞在臨床中成功治愈數(shù)例乙型肝炎患者，CIK細(xì)胞的臨床療效初步得到確認(rèn)［9］。國內(nèi)代表性研究人員也將致敏后的CIK細(xì)胞與免疫球蛋白聯(lián)合應(yīng)用共同治療慢性乙肝患者，據(jù)研究結(jié)果顯示，治療后患者完全應(yīng)答率達26%，部分應(yīng)答率超過50%，表明慢性乙肝經(jīng)過CIK細(xì)胞治療可達到良好的臨床效果。同時，其他研究學(xué)者也發(fā)現(xiàn)CIK細(xì)胞治療慢性乙肝的獨特之處，有學(xué)者將CIK細(xì)胞通過輸液的方式輸入人體內(nèi)進行治療，療程結(jié)束后，約50%的患者血清學(xué)顯示病毒含量已明顯減少，血液中抗原提呈細(xì)胞的能力增強［10］。在該次實驗中，我院研究人員CIK置于體外環(huán)境中進行人工培養(yǎng)，目的是獲取高含量的CIK細(xì)胞，以乙肝表面抗原激活CIK，培養(yǎng)后再次注入患者的體內(nèi)。研究人員提供CIK細(xì)胞體外培養(yǎng)的環(huán)境可以保證細(xì)胞在增殖過程中免受體內(nèi)微環(huán)境的影響，以免造成免疫耐受。研究人員發(fā)現(xiàn)，致敏后的CIK細(xì)胞抗病毒能力和殺傷病毒能力均較以往有所提高［11］。治療后，患者應(yīng)答總有效率為76.67%，15例為完全應(yīng)答，31例為部分應(yīng)答; 8例患者機體內(nèi)監(jiān)測不到HBV-DNA，轉(zhuǎn)陰率達到13.33%。慢性乙肝患者HBsAg水平和ALT水平顯著下降。

CIK中主要效用細(xì)胞是CD3+CD5+6，在血液中的含量極少，因此需在體外進行培養(yǎng)。在體外條件下培養(yǎng)1個月后，細(xì)胞增殖速度發(fā)生巨大變化，增殖速度為原來的1 000倍，可獲取大量的目的細(xì)胞［12］。同時，CD3+CD8+細(xì)胞含量也發(fā)生變化，由原來的20%升高至60%～80%。在體外培養(yǎng)和培養(yǎng)后輸入患者體內(nèi)兩種途徑下，患者的效應(yīng)細(xì)胞均明顯增加。本次試驗圍繞CIK對于慢性乙肝性肝硬化的治療進行，結(jié)果顯示ALT、ALB、TP、GLO及TBIL指標(biāo)較治療前好轉(zhuǎn)，表明患者肝內(nèi)炎性病變好轉(zhuǎn)，而與肝臟慢性病變相關(guān)的PLT等指標(biāo)在治療前后則變化不明顯。由于患者在治療前存在個體差異，因此治療前肝功能水平可對治療后的肝功能造成一定影響，我院研究人員針對此類指標(biāo)做了深入性試驗，結(jié)果顯示大部分患者在治療后好轉(zhuǎn)，僅小部分患者在治療后出現(xiàn)病情惡化，表明CIK細(xì)胞治療慢性乙肝性肝硬化的整體療效確切。同時，試驗結(jié)果顯示CIK治療后患者并發(fā)癥發(fā)生率不高，且程度較輕，表明安全性較好。

綜上所述，CIK細(xì)胞治療慢性HBV DNA陽性肝硬化療效較好，應(yīng)在臨床推廣。

參考文獻

1陳宛麗，楊瑩，張威，等.CIK細(xì)胞治療慢性乙型肝炎的臨床療效觀察.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2012，6:45-46.

2陳劍，王少揚，王賢，等.自體CIK細(xì)胞治療肝郁脾虛型慢性乙型肝炎療效觀察.中西醫(yī)結(jié)合肝病雜志，2014，24:31-32.

3王少揚，劉海周，馬衛(wèi)閩，等.恩替卡韋聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞序貫治療慢性乙型肝炎患者樹突狀細(xì)胞相關(guān)功能觀察.現(xiàn)代免疫學(xué)，2015，35:285-288.

4羅濤，許仲平，吳傳有，等.DC-CIK共培細(xì)胞聯(lián)合其他方法治療肝癌的研究進展.現(xiàn)代臨床醫(yī)學(xué)，2015，41:168-171.

5張浩，管世鶴.慢性乙型肝炎患者HBV感染外周血單個核細(xì)胞的研究進展.國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2015，36:1915-1917.

6余靈祥，李志偉，張培瑞，等.阿德福韋酯與拉米夫定治療慢性乙肝的療效對比.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展，2015，15:3280-3321.

7劉波，董靜，張駿飛，等.臍血來源或自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞聯(lián)合干擾素治療慢性乙型肝炎的安全性和有效性分析.臨床肝膽病雜志，2014，30:869-872.

8朱惠平，張全安.自體細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞輸注聯(lián)合紫杉醇順鉑方案治療晚期食管癌的療效分析.中國腫瘤臨床與康復(fù)，2014，21:837-839.

9劉丹，王嵬.DC-CIK細(xì)胞聯(lián)合雙徑路化療治療非小細(xì)胞肺癌的臨床療效觀察.中國醫(yī)藥指南，2015，13:127.

10諶平，何成宜，陳志英.合成免疫策略治療慢性乙肝病毒感染綜述.集成技術(shù)，2015，4:45-54.

11 Malyszko J.Mechanism of endothelial dysfunction in chronic kidney disease.Clin Chim Acta，2010，411:1412-1420.

12張冰，施明，謝云波，等.慢性丙型肝炎患者CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)培養(yǎng)及細(xì)胞亞群分析.肝臟，2012，17:311-314.

·論著·

(收稿日期:2015－07－14)

doi:10.3969/j.issn.1002－7386.2016.04.033

【中圖分類號】R 657.31

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1002－7386(2016) 04－0575－03

作者單位: 055550河北省寧晉縣醫(yī)院