于　靜，勞秀杰，陳彥永，何小江，代　兵，趙阿勇，王曉杜，宋厚輝（浙江農林大學動物科技學院，浙江臨安311300）

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豬圓環(huán)病毒2型實時熒光定量PCR檢測方法的建立

于靜，勞秀杰，陳彥永，何小江，代兵，趙阿勇，王曉杜，宋厚輝
（浙江農林大學動物科技學院，浙江臨安311300）

摘要：豬圓環(huán)病毒2型（porcine circovirus 2, PCV2），是感染豬Sus scrofa domestica的一種單鏈DNA病毒。建立一種快速、靈敏的檢測方法，對于PCV2感染豬的篩選和疾病預防非常重要。根據(jù)PCV2 ORF2基因保守區(qū)，設計了熒光定量聚合酶鏈式反應（PCR）引物，利用SYBR Green作為熒光染料建立了一種定量檢測PCV2的PCR方法。結果表明：該方法具有靈敏度高、特異性強和重復性好的優(yōu)點，每微升的最低檢測限低至101拷貝DNA。利用該方法對34份PCV2陽性臨床樣本進行檢測，檢測符合率為100%，明顯高于普通PCR方法的50.0%。因此，本研究建立的PCV2實時熒光定量PCR檢測方法為該疾病的預防和控制提供一種有效的檢測工具。圖4表4參26

關鍵詞：動物學；豬；豬圓環(huán)病毒2型；實時熒光定量PCR

豬圓環(huán)病毒2（porcine circovirus 2，PCV2），是最小的DNA病毒，斷奶仔豬Sus scrofa domestica多系統(tǒng)衰竭綜合征（postweaning multisystemic wasting syndrome, PMWS）的主要病原，成為嚴重阻礙養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展的主要病原之一［1-3］。國內外針對PCV2致病機制、診斷方法以及疫苗研制等方面開展了大量的研究［1, 4］。然而，PCV2依然阻礙著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展，主要原因可能是其臨床發(fā)病與亞臨床感染豬群中病毒量的不同，檢測過程容易造成漏檢，導致錯誤診斷。因此，發(fā)展一種高靈敏度、快速檢測PCV2的方法尤為重要。豬圓環(huán)病毒（PCV）分為PCV1和PCV2等2種基因型，它們基因組結構相似，均含有ORF1和ORF2等2個主要的開放閱讀框。ORF1是引起PCV1和PCV2抗原交叉反應的主要原因，其變異很小，同源性高達85%；而ORF2基因是PCV2的重要抗原基因，編碼病毒衣殼蛋白（Cap蛋白）［5］，其變異較大，在兩型PCV之間不存在抗原交叉反應，被視為PCV1和PCV2的特異性鑒別抗原［6-8］，并在臨床檢測中取得了良好的效果。基于ORF2的較大變異，可以設計特異性引物對PCV的2個基因型進行鑒定，已成為PCR方法鑒定PCV2的重要靶基因［9］。基于ORF2的這些優(yōu)勢，本研究也選擇ORF2作為鑒定引物設計的首選基因。聚合酶鏈式反應（PCR）方法簡單、方便、快速、敏感，在疾病檢測中廣泛應用，但其高假陽性和易污染的缺點依然存在。PCV2的抗體檢測，敏感性和特異性都比較好，但是價格昂貴，技術要求較高。像多重PCR、巢式PCR等技術，雖然也可以達到很高的靈敏度，但是卻不能定量。實時熒光定量PCR方法，不僅操作簡便、敏感性高、重復性好、省時和可定量分析等優(yōu)點，是病毒檢測的重要方法。因此，本試驗利用實時熒光定量PCR技術構建快速、靈敏檢測PCV2的方法，以適應實驗室和臨床中對PCV2的實時定量檢測。

1　材料與方法

1.1材料和臨床病料

PCV2，豬藍耳病毒（PRRSV，lelystad virus），豬細小病毒（porcine parvovirus，PPV）和豬瘟病毒（CSFV，hogcholera virus）等菌株由浙江農林大學動物預防醫(yī)學與公共衛(wèi)生實驗室保存。19份病灶樣品采自杭州國茂生態(tài)農業(yè)科技開發(fā)有限公司（簡稱：國茂），11份陽性病料和4份陰性對照由杭州檢疫中心（杭州國正檢測技術有限公司，簡稱：國正）惠贈。

1.2引物設計與合成

ORF2是PCV2的主要免疫原基因，也是主要用于PCR鑒別的基因［9］。根據(jù)GenBank公布的PCV2 ORF2基因序列，應用Primer 5.0軟件設計ORF2基因全長克隆、普通PCR以及實時熒光定量PCR引物，并通過BLAST對其特異性進行分析。引物由上海生工生物工程公司合成，引物序列詳見表1。

表1　實驗中所用引物Table 1 Primers used in this study

1.3陽性質粒的制備與稀釋

將擴增的ORF2片段與pZERO-blunt載體連接，轉化大腸埃希菌Escherichia coli DH5α，提取重組質粒，并進行測序。用紫外分光光度計測定重組質粒的吸光度D（260）和D（280），計算出重組質粒的拷貝數(shù)，用EASY Dilution試劑將陽性重組質粒稀釋到1010拷貝·μL-1，再進行10倍梯度稀釋，以108，107，106，105，104，103，102，101，100拷貝·μL-19個拷貝數(shù)梯度作為標準模板，-20℃凍存?zhèn)溆?。質粒質量濃度（g·L-1）=D（260）×50（g·L-1）/1 000×準模板釋稀釋倍數(shù)。

拷貝數(shù)計算公式：拷貝數(shù)（拷貝·μL-1）=質粒濃度（g·μL-1）×阿弗加德羅常數(shù)/重組質粒分子量。

1.4實時熒光定量反應條件

實時熒光定量PCR反應采用20 μL體系，其組分如下：SYBRRPremix Ex Taq GC（2×）10 μL，qP1 （10 μmol·L-1）0.4 μL，qP2（10 μmol·L-1）0.4 μL，ROX Reference Dye II（50×）0.4 μL，雙蒸水7.8 μL，模板1 μL。PCR擴增條件：95℃預變性30 s，按95℃10 s，60℃20 s，72℃30 s，進行40個循環(huán)。

1.5標準曲線的建立

以重組質粒為標準品，進行10倍梯度稀釋，取108～100拷貝·μL-1質粒為模板，用優(yōu)化的實時熒光定量PCR體系及程序進行檢測，同時設空白對照，每個標準品及空白對照均為3個平行重復。以起始模板拷貝數(shù)為x軸，循環(huán)閾值（Ct）值為y軸做回歸曲線，建立PCV2實時熒光定量PCR檢測的標準曲線。

1.6實時熒光定量PCR方法的重復性分析

對不同比例的標準品DNA 104, 103和102拷貝·μL-1進行批間和批內重復性試驗。樣本有3個平行重復（批內重復），分別進行3次重復（批間重復）。對所得Ct值的平均值、標準差和變異系數(shù)進行分析。

1.7敏感性和特異性分析

敏感性分析：以不同梯度標準品為模板，分析最低檢出限，比較常規(guī)PCR與實時熒光定量PCR的敏感性差別。特異性分析：用所建立的實時熒光定量PCR方法對已知陽性樣品豬圓環(huán)病毒2（PCV2），豬細小病毒（PPV），豬瘟病毒（CSFV）和豬藍耳病毒（PRRSV）病毒DNA（或cDNA）進行檢測，確定該方法的特異性。

1.8臨床樣本的檢測

對采集的34份臨床樣品進行檢測。用試劑盒提取DNA，用上述建立的方法進行檢測。

2　結果與分析

2.1標準質粒的制備

以PCV2 DNA為模板，ORF2全長引物ORF2-F與ORF2-R進行PCR擴增，目的片段大小為702 bp，連接到pZERO-blunt載體上，并用載體上的酶切位點進行雙酶切，出現(xiàn)載體片段和目的基因片段大小與預期一致，表明重組質粒構建正確（圖1）。測序結果與目的片段序列也完全一致。抽提重組質粒，并梯度稀釋為108，107，106，105，104，103，102，101，100拷貝·μL-19個比例的質粒為標準模板。

2.2實時熒光定量PCR標準曲線的建立

以梯度稀釋重組質粒為模板進行標準曲線的制作。根據(jù)PCV2擴增動力學曲線，系統(tǒng)自動生成標準曲線，拷貝數(shù)（x）與循環(huán)閾值（Ct）之間的線性關系曲線表達式（圖2C）為：Ct=-3.38× lgx + 35.98，其斜率為-3.38，相關系數(shù)（R2）為1，表明該標準曲線的線性度較好；PCR的擴增效率為97.6%，且表明實時熒光定量PCR最低檢測線為101拷貝·μL-1。擴增曲線平滑（圖2A），每個樣品之間間隔均勻，陽性樣品Ct值均在33以下，陰性對照樣品沒有擴增，最低檢出限為101，因此，可以認為Ct值為33時是陰性樣品和陽性樣品的臨界值，即Ct≤33可判為陽性，Ct＞33判為陰性。溶解曲線分析可以反映擴增產物的正確性，是否有非特異性以及熒光信號是否由引物二聚體造成。本實驗溶解曲線（圖2B）特征峰單一，Tm值（解鏈溫度）在86℃左右，表明是特異擴增。由此可以證明本研究建立的實時熒光定量PCR檢測PCV2方法完全可信，可用于后續(xù)實驗分析。

2.3實時熒光定量PCR方法的重復性分析

實驗重復性是方法穩(wěn)定性的標志。為了驗證本研究建立的實時熒光定量PCR的重復性，我們以不同比例的標準品DNA 104，103和102拷貝·μL-1進行批間重復性試驗，3份模板的3次批內（表2）和批間（表3）重復檢測的Ct值誤差均不到0.5，變異系數(shù)均小于2%，結果表明該方法具有較高的重復性。

表2　實時熒光定量PCR方法的批內重復性實驗結果Table 2　Repetitive experimental results of intra-assay ofreal-time PCR method

表3　實時熒光定量PCR方法的批間重復性實驗結果Table 3 Repetitive experimental results inter-assay of real-time PCR method

2.4特異性分析

PCR擴增易出現(xiàn)假陽性，會造成誤檢，給生產帶來負面效應。因此，我們對本研究建立的實時熒光定量PCR方法特異性進行分析，結果表明（圖3）：經實時熒光定量PCR檢測，只有PCV2在Ct為18左右出現(xiàn)特異性擴增曲線，而檢測的豬細小病毒（PPV），豬瘟病毒（CSFV），豬藍耳病毒（PRRSV）等樣品Ct值均大于33或無擴增，被判定為陰性。以上結果證明：本研究建立的實時熒光定量PCR檢測PCV2的方法特異性高，可以用于后續(xù)臨床樣品分析。

圖3　特異性實驗結果Figure 3　Result of specific analysis

2.5敏感性分析

敏感性對評價檢測方法的靈敏性非常重要，因此，我們分析了普通PCR和實時熒光定量PCR這2種方法的敏感性。結果發(fā)現(xiàn)：普通PCR有擴增條帶的模板濃度為104拷貝·μL-1，而實時熒光定量PCR方法在模板比例為101拷貝·μL-1（圖4）時有擴增，也就表明實時熒光定量PCR檢測PCV2的敏感性比普通PCR的敏感性高1 000倍。以上結果表明：本研究建立的實時熒光定量PCR檢測PCV2的方法敏感性高。

圖4　敏感性實驗結果Figure 4 Results of sensitivity analysis

2.6臨床樣本的檢測

臨床樣品檢測是技術推廣的前提。本研究從杭州周圍豬場采集的34份樣品，其中陽性病灶樣品30份，陰性樣品4份，通過檢測發(fā)現(xiàn)普通PCR檢測方法符合率為50.0%，實時熒光定量PCR檢測符合率為100%（表4），且?guī)Р悠返目截悢?shù)為101～104拷貝·μL-1。以上結果表明：本研究建立的實時熒光定量PCR檢測PCV2方法比普通PCR方法靈敏度高，能完全適合豬場疾病的檢測，且能夠定量分析樣品的病毒量。

表4　臨床樣品檢測結果Table 4 Analysis of clinical samples

3　討論

Ⅱ型豬圓環(huán)病毒可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（PMWS），育肥豬皮炎與腎病綜合征（PDNS），增生性壞死性肺炎（PNP），豬呼吸道綜合征，懷孕母豬的繁殖障礙、新生仔豬的先天性震顫（CT）和新生仔豬腹瀉病等疾?。?, 10-14］。中國很多地方豬養(yǎng)殖場PCV2陽性率高達100%，仔豬死亡率高達30%。目前，對PCV2引起疾病的診斷標準、致病機理以及對病毒本身的防治研究還不清晰［15］。PCV2引起疾病的預防主要通過注射疫苗，但是免疫效果不理想。

PCV2引起疾病的診斷主要采用臨床癥狀、病理剖解和實驗室診斷等，這些方法診斷結果準確，但耗時長、工作量大，實際生產中難以推廣應用［16］。此外，這些方法對亞臨床感染豬的診斷經常會遭遇困難。為了解決這些問題，實驗室開展了血清中和實驗、ELISA、膠體金試紙和PCR等方法用于檢測PCV2［17-21］。研究發(fā)現(xiàn)，豬圓環(huán)病毒2-dCap-ELISA抗體檢測試劑盒在檢測PCV2中具有成本低、不需要特殊儀器且能滿足基層需要的優(yōu)點［18］，但是操作過程比較繁瑣，中間環(huán)節(jié)可能會帶來污染。而瓊脂擴散試驗和圓環(huán)病毒抗體膠體金試紙條檢測PCV2的方法，雖然特異性、穩(wěn)定性、符合率等都很高［17］，但是依然存在較高假陽性問題。近年來，實時熒光定量PCR方法在疾病檢測方面的應用，進一步提高了檢測的靈敏度，縮短了檢測時間。

本研究根據(jù)PCV2 ORF2基因設計實時熒光定量PCR引物。ORF2編碼病毒的核衣殼蛋白（Cap），該蛋白可引起感染豬產生高含量的抗體，且在2個血清型（PCV1和PCV2）之間無交叉反應性，是檢測病毒抗體水平的良好抗原［22］。因此，ORF2也成為PCR鑒別PCV2的重要基因［9］。郭慧娟等［23］根據(jù)ORF2設計TaqMan實時熒光定量PCR引物，建立了PCV2檢測方法，其靈敏度高達到4.53×102拷貝·μL-1，而曹偉偉等［16］TaqMan實時熒光定量PCR方法的最低檢測限度為5.06拷貝·μL-1。而SYBR Green I Realtime PCR檢測方法的靈敏度基本在10～100拷貝·μL-1，比普通PCR檢測方法檢測靈敏度提高100～1 000倍［24-25］。

本研究建立的實時熒光定量PCR檢測PCV2的方法能夠對處于亞臨床狀態(tài)豬進行檢測，可以為該病的治療搶得寶貴時間。本研究建立的實時熒光定量PCR方法與普通PCR相比，靈敏度提高了1 000倍，和已報道實時熒光定量PCR［16, 23, 25-26］檢測PCV2的靈敏度相似?？傮w來說，實時熒光定量PCR方法檢測費用較高，所需儀器和操作環(huán)境要求較高。但是，本研究建立的實時熒光定量PCR檢測PCV2的方法重復性和特異性高，不會造成錯診，會大大減少因病毒蔓延導致的豬場經濟損失。此外，本研究建立的實時熒光定量PCR還可以對PCV2進行準確定量，對感病豬的早期診斷和豬場分類防治管理提供了重要的依據(jù)。

4　參考文獻

［1］GRAU-ROMA L, FRAILE L, SEGALES J.Recent advances in the epidemiology, diagnosis and control of diseases caused by porcine circovirus type 2［J］.Vet J, 2011, 187（1）: 23 - 32.

［2］ALLAN G M, ELLIS J A.Porcine circoviruses: a review［J］.J Vet Diagn Invest, 2000, 12（1）: 3 - 14.

［3］陳溥言,華修國.斷奶仔豬多系統(tǒng)消耗綜合征［J］.畜牧與獸醫(yī), 2002, 34（7）: 33 - 35.CHEN Puyan, HUA Xiuguo.Postweaning multisystemic wasting syndrome［J］.Anim Husb & Vet Med, 2002, 34（7）: 33 - 35.

［4］田曉婷,李寶玉,柳紀省.豬圓環(huán)病毒的分子生物學與檢測方法的研究現(xiàn)狀［J］.中國農學通報, 2012, 28（14）: 66 - 72.TIAN Xiaoting, LI Baoyu, LIU Jixing.A review for the molecular biology characteristics and molecular diagnosis methods of porcine circovirus［J］.Chin Agric Sci Bull, 2012, 28（14）: 66 - 72.

［5］NAWAGITGUL P, MOROZOV I, BOLIN S R, et al.Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein［J］.J Gen Virol, 2000, 81（9）: 2281 - 2287.

［6］BLANCHARD P, MAHE D, CARIOLET R, et al.An ORF2 protein-based ELISA for porcine circovirus type 2 antibodies in post-weaning multisystemic wasting syndrome［J］.Vet Microbiol, 2003, 94（3）: 183 - 194.

［7］陳陸,楊霞,王江輝,等.豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）河南分離株進化分析及ORF2基因的表達［J］.農業(yè)生物技術學報, 2009, 17（4）: 561 - 566.CHEN Lu, YANG Xia, WANG Jianghui, et al.Phylogenetic analysis of porcine circovirus 2（PVC2）isolated from Henan province and expression of the ORF2 gene in Escherichia coli［J］.J Agric Biotechnol, 2009, 17（4）: 561 - 566.

［8］王子馨,李坤,劉金朋,等.PCV2 ORF2基因與豬IL-18基因共表達DNA疫苗的免疫原性［J］.中國獸醫(yī)學報, 2013，33（4）: 532 - 537.WANG Zixin, LI Kun, LIU Jinpeng, et al.Enhancement of DNA vaccine potency against PCV2 by coexpression of PCV2 ORF2 and IL-18 genes［J］.Chin J Vet Sci, 2013，33（4）: 532 - 537.

［9］CHEUNG A K.Transcriptional analysis of porcine circovirus type 2［J］.Virology, 2003, 305（1）: 168 - 180.

［10］BRUNBORG I M, FOSSUM C, LIUM B, et al.Dynamics of serum antibodies to and load of porcine circovirus type 2 （PCV2）in pigs in three finishing herds, affected or not by postweaning multisystemic wasting syndrome［J］.Acta Vet Scand, 2010, 52: 22 - 31.

［11］GUO Longjun, LU Yuehua, WEI Yanwu, et al.Porcine circovirus type 2（PCV2）: genetic variation and newly emerging genotypes in China［J］.Virol J, 2010, 7（1）: 273 - 285.

［12］KURTZ S, GRAU-ROMA L, CORTEY M, et al.Pigs naturally exposed to porcine circovirus type 2（PCV2）generate antibody responses capable to neutralise PCV2 isolates of different genotypes and geographic origins［J］.Vet Res, 2014, 45: 29 - 38.

［13］OPRIESSNIG T, MENG Xiangjin, HALBUR P G.Porcine circovirus type 2-associated disease: update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies［J］.J Vet Diagn Invest, 2007, 19（6）: 591 - 615.

［14］XIAO C T, HALBUR P G, OPRIESSNIG T.Global molecular genetic analysis of porcine circovirus type 2（PCV2）sequences confirms the presence of four main PCV2 genotypes and reveals a rapid increase of PCV2d［J］.J Gen Virol, 2015, 96: 1830 - 1841.

［15］STEINER E, BALMELLI C, GERBER H, et al.Cellular adaptive immune response against porcine circovirus type 2 in subclinically infected pigs［J］.BMC Vet Res, 2009, 5（1）: 45 - 57.

［16］曹偉偉,郭抗抗,許信剛,等.豬圓環(huán)病毒Ⅱ型TaqMan實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用［J］.西北農林科技大學學報:自然科學版, 2013, 41（1）: 13 - 18.CAO Weiwei, GUO Kangkang, XU Xingang, et al.Establishment and application of Taq Man real-time fluorescent quantitative PCR for detecting porcine circovirus typeⅡ［J］.J Northwest A & F Univ Nat Sci Ed, 2013, 41（1）: 13 - 18.

［17］苗麗娟,劉玉茹,李靜姬,等.Ⅱ型豬圓環(huán)病毒Cap蛋白瓊脂擴散試驗檢測方法的建立［J］.黑龍江畜牧獸醫(yī), 2013, 46（9）: 105 - 106.MIAO Lijuan, LIU Yuru, LI Jingji, et al.Establishment of Cap protein agar diffusion assay for detection of porcine circovirus typeⅡ［J］.Heilongjiang Animal Sci Vet Med, 2013, 46（9）: 105 - 106.

［18］趙玉龍,焦玉蘭,郁宏偉,等.一種豬圓環(huán)病毒Ⅱ型ELISA抗體檢測試劑盒的臨床應用［J］.中國獸藥雜志, 2011, 45（3）: 31 - 34.ZHAO Yulong, JIAO Yulan, YU Hongwei, et al.Clinical applications of antibody detection ELISA kit for porcine circovirus type 2［J］.Chin J Vet Drug, 2011, 45（3）: 31 - 34.

［19］岳豐雄,崔尚金,冉多良,等.PCV2, PPV, PRV和PRRSV多重PCR檢測方法的建立及初步應用［J］.中國獸醫(yī)科學, 2008, 38（8）: 691 - 696.YUE Fengxiong, CUI Shangjin, RAN Duoliang, et al.Establishment and application of a multiplex PCR assay for simultaneous detection of PCV2, PPV, PRV and PRRSV［J］.Chin Vet Sci, 2008, 38（8）: 691 - 696.

［20］YUE Fengxiong, CUI Shangjin, ZHANG Chaofan, et al.A multiplex PCR for rapid and simultaneous detection of porcine circovirus type 2, porcine parvovirus, porcine pseudorabies virus, and porcine reproductive and respiratory syndrome virus in clinical specimens［J］.Viru Gen, 2009, 38（3）: 392 - 397.

［21］LIU Changming, IHARA T, NUNOYA T, et al.Development of an ELISA based on the baculovirus-expressed capsid protein of porcine circovirus type 2 as antigen［J］.J Vet Med Sci, 2004, 66（3）: 237 - 242.

［22］郭官鵬,劉暢,陳龍彪,等.豬圓環(huán)病毒2型ORF2基因截斷表達及ELISA抗體檢測方法的初步建立［J］.中國獸醫(yī)學報, 2014, 34（7）: 1059 - 1064.GUO Guanpeng, LIU Chang, CHEN Longbiao, et al.Development of an indirecr ELISA based on prokaryotic expression of truncated ORF2 gene of porcine circovirus type 2［J］.Chin J Vet Sci, 2014, 34（7）: 1059 - 1064.

［23］郭慧娟,李秀麗,張國偉,等.豬圓環(huán)病毒2型TaqMan熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.中國畜牧獸醫(yī), 2014, 41（5）: 39 - 45.GUO Huijuan, LI Xiuli, ZHANG Guowei, et al.Establishment of Taq-Man real-time PCR for detection of porcine circovirus typeⅡ［J］.China Anim Husb & Vet Med, 2014, 41（5）: 39 - 45.

［24］張福良,宋長緒,楊鳴琦,等.豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)學報, 2006, 26 （3）: 248 - 250.ZHANG Fuliang, SONG Changxu, YANG Mingqi, et al.Development of fluorescent quantitative PCR assay for PCV2 detection［J］.Chin J Vet Sci, 2006, 26（3）: 248 - 250.

［25］李鵬,郭軍慶,金前躍,等.豬圓環(huán)病毒2型熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.華北農學報, 2014, 29（2）: 66 -70.LI Peng, GUO Junqing, JIN Qianyue, et al.Rapid detection of porcine circovirus type 2 using a SYBR Green I realtime PCR［J］.Acta Agric Boreal-Sin, 2014, 29（2）: 66 - 70.

［26］董林,王艷萍,魏鳳,等.豬圓環(huán)病毒2型SYBR GreenⅠ實時熒光定量PCR檢測方法的建立［J］.中國獸醫(yī)科學, 2013, 43（10）: 1073 - 1078.DONG Lin, WANG Yanping, WEI Feng, et al.Development and application of a SYBR Green I real-time fluorescent quantitative PCR method for detection of type 2 porcine circovirus［J］.Chin J Vet Sci, 2013, 43（10）: 1073 - 1078.

A real-time PCR method for detection of porcine circovirus 2

YU Jing, LAO Xiujie, CHEN Yanyong, HE Xiaojiang, DAI Bing, ZHAO Ayong, WANG Xiaodu, SONG Houhui

（School of Animal Science and Technology, Zhejiang A & F University, Lin’an 311300, Zhejiang, China）

Abstract:To develop an accurate and rapid detection method for disease screening and prevention with porcine

circovirus type 2（PCV2）, a single-strand DNA virus that infects pigs, primers targeted to the ORF2 fragment of the PCV2 conserved region were designed.A real time polymerase chain reaction（PCR）method was developed using SYBR Green as a fluorescent dye and serial dilutions of ORF2 recombinant plasmid to construct a standard curve for an absolute quantification.Results showed that the detection limit was obtained with 101

copy DNA per microliter.This method exhibited 1 000 times higher sensitivity than conventional PCR, only specific identification of PCV2, and better repeatability with the less than 2% variation coefficient of intra- or inter-assay experiments.A total of 34 PCV2 positive clinical samples were confirmed using this real time PCR method, demonstrating 100% agreement in comparison with the conventional PCR having only 50% agreement.This real time PCR method could provide a valuable tool for PCV2 prevention and control.［Ch, 4 fig.4 tab.26 ref.］

Key words:zoology; porcine; porcine circovirus 2; real-time PCR

作者簡介：于靜，講師，博士，從事畜禽遺傳與疾病控制研究。E-mail: yujing_2009@163.com。通信作者：宋厚輝，研究員，博士，從事動物疫病防控和公共衛(wèi)生研究。E-mail: songhh@zafu.edu.cn

基金項目：浙江省科學技術公益項目（2014C32061）；浙江農林大學人才啟動項目（2011FR025，2013FR077）；浙江省自然科學基金資助項目（LQ14C010007）；浙江農林大學大學生科技創(chuàng)新訓練計劃項目（201301017）；浙江農林大學面上基金項目（2013FK001）

收稿日期：2015-04-19；修回日期：2015-06-22

doi:10.11833/j.issn.2095-0756.2016.02.023

中圖分類號:S852.3

文獻標志碼：A

文章編號：2095-0756（2016）02-0357-07