劉洪國濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山東 濰坊 261053

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EGCG對(duì)腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制的研究

劉洪國
濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，山東 濰坊 261053

摘要：探討了表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。結(jié)果表明，與腎缺血再灌注損傷模型組相比，EGCG組腎功能改善，腎組織病理改變，Wnt3a、b-catenin、p53、p21、MDA、IL-6、IFN-g和TNF-a表達(dá)明顯減少，而CAT，GPX和SOD表達(dá)明顯增加。說明EGCG預(yù)處理減輕腎缺血再灌注損傷與抑制Wnt3a/b-catenin/p53信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)。

關(guān)鍵詞：表沒食子兒茶素沒食子酸酯；腎缺血再灌注損傷；炎癥；氧化應(yīng)激；Wnt/b-catenin

組織器官缺血會(huì)引起細(xì)胞代謝功能障礙和組織結(jié)構(gòu)破壞，而當(dāng)組織器官恢復(fù)血供時(shí)，組織器官損傷反而出現(xiàn)加重的現(xiàn)象稱之為缺血再灌注損傷（Ischemia-reperfusion injury，IRI）[1-4]。腎臟由于其血流高灌注的特性，發(fā)生缺血再灌注損傷的機(jī)率較高。目前，研究發(fā)現(xiàn)其發(fā)病機(jī)制涉及炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等[1-4]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）是綠茶中最為穩(wěn)定，含量最高的活性成分，最近研究發(fā)現(xiàn)，它具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的活性[5-6]。而炎癥和氧化應(yīng)激是腎缺血再灌注損傷的重要致病機(jī)制[5-6]。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠構(gòu)建腎缺血再灌注損傷模型[1-4]，探討EGCG對(duì)大鼠腎缺血再灌注損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、儀器和動(dòng)物

EGCG（Sigma，美國，20130726），水合氯醛（Google生物）。Wnt3a（CST，USA），b-catenin （CST，USA），β-actin（abgent，USA），p53（abgent，USA），p21（abgent，USA），TRIzol reagent （Invitrogen，USA，13316-012），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（GeneCopoeia，USA，A2302-1），SYBR green（Takara，Japan，D01312A），RT-PCR引物（擎科生物技術(shù)有限公司，訂單號(hào)SY13032221，序列號(hào)：TNF-α：F：CTGAACTTCGGGGTGATCGG，R：GGC TTGTCACTCGAATTTTGAGA；IFN-g：F：A GCTTCCTTGTGCAAGTGTCT，R：GACAG CCCAGGTCAAAGGTT；IL-6：CTGCAAGA GACTTCCATCCAG；R：AGTGGTATAGACA GGTCTGTTGG；β-actin：F：AGAGGGAAATC GTGCGTGAC，R：CAATAGTGATGACCTG GCCGT），HE試劑由濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)院病理實(shí)驗(yàn)室配制。紫外分光光度計(jì)（Thermo fisher）、逆轉(zhuǎn)錄儀（Eppendorf），RT-PCR儀（BIO-RAD IQ5），顯微鏡（Olympus BX51）及成像系統(tǒng)（HITMAS-30）均為濰坊醫(yī)學(xué)院提供。SD大鼠購自北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，屬SPF級(jí)，質(zhì)量合格證號(hào)430117021，飼養(yǎng)于濰坊醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，許可證號(hào)SYXK(魯)2011-0027，設(shè)施使用證明號(hào)00124732。

1.2 動(dòng)物模型的建立與分組

50只健康雄性SD大鼠，2月齡，平均體質(zhì)量250～300 g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，狀態(tài)良好，按體重隨機(jī)分為假手術(shù)（Sham）、腎缺血再灌注損傷組（IRI）和EGCG不同濃度組（EGCG組），每組10只。EGCG組術(shù)前45 min給予EGCG（10、20、40 mg·kg-1）腹腔注射。Sham組和IRI組則給予等體積腹腔注射生理鹽水；Sham組給予假手術(shù)，IRI組和EGCG組給予腎缺血再灌注手術(shù)。

腎缺血再灌注手術(shù)方式：大鼠水合氯醛麻醉狀態(tài)下，行腹部正中切口，游離組織，分離暴露腎蒂，用血管夾閉左側(cè)腎蒂，紗布覆蓋切口置于37℃溫箱45 min，然后松開血管夾，恢復(fù)腎臟血流灌注，去除右側(cè)腎臟，縫合腹部，術(shù)畢放回動(dòng)物房。

假手術(shù)與上類似，僅開腹后不夾閉左側(cè)腎蒂。松開血管夾后24 h后處死大鼠，收集血清和腎臟標(biāo)本。實(shí)驗(yàn)中，動(dòng)物狀態(tài)較好，蘇醒較快，無死亡動(dòng)物，術(shù)后給予正常飲食飲水。

1.3 標(biāo)本收集

各組大鼠在腎臟再灌注24 h后，行腹主動(dòng)脈取血，室溫下3 000 r·min-1離心10 min后取上清液檢測(cè)血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和血清肌酐（Creatinine，Cr）。開腹取左腎；三分之一左腎置于多聚甲醛做石蠟切片，其余組織凍于－80℃冰箱。

1.4 腎臟病理檢查

左腎下極組織采用10%多聚甲醛固定，常規(guī)脫水浸蠟（Thermo Fisher），石蠟包埋，4 μm切片，脫蠟透明后由腎內(nèi)科實(shí)驗(yàn)室HE試劑進(jìn)行HE染色，光鏡下觀察形態(tài)結(jié)構(gòu)并評(píng)分。

分級(jí)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[7]：0，<10%；1，10%～25%；2，25%～50%；3，50%～75%；4，75%～100%。

1.5 Western印跡檢測(cè)

取腎組織于精微天平稱重，按照每50 mg組織中加入1 mL RIPA裂解液（以1∶50加入50×cocktail），冰上勻漿，裂解30 min后，4℃12 000 r·min-1離心30 min后取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。以含50 μg蛋白質(zhì)的上樣量，經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳（5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80～100 V）后轉(zhuǎn)膜（PVDF膜，恒流300 mA），然后洗膜，以5%脫脂奶粉（TBST配制）封閉1 h，Wnt（1∶1 000），β-catenin （1∶500），p53（1∶500），p21（1∶500），β-actin（1∶3 000）單抗孵育過夜，再次振洗后加入羊抗兔IgG-HRP（二抗）37℃孵育1 h。洗膜后加ECL試劑，Kodak化學(xué)發(fā)光儀曝光顯示目的蛋白，并拍照。以Quantity one對(duì)條帶進(jìn)行定量分析，以目的條帶和β-actin條帶積分灰度值比值作為結(jié)果。

1.6 RT-PCR檢測(cè)

稱取適量腎組織，于液氮中研磨成粉末狀提取總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)量濃度，逆轉(zhuǎn)錄以及擴(kuò)增反應(yīng)按試劑盒說明書進(jìn)行。以管家基因β-actin作為內(nèi)參對(duì)照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2-ΔΔCT計(jì)算IL-6、TNF-α 和IFN-γ相對(duì)表達(dá)量。表1為實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)的引物序列.

1.7 ELISA檢測(cè)

按照ELISA試劑盒說明書操作步驟檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α、IFN-γ表達(dá)水平。

1.8 MDA、CAT、GPx和SOD含量的檢測(cè)

按照ELISA試劑盒說明書測(cè)定血清和腎組織MDA、CAT、GPx和SOD的含量，具體步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用±SD表示，資料采用單因素方差分析（ANOVA），多個(gè)樣本之間的兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 EGCG呈濃度依賴性減輕腎缺血再灌注損傷

如表1所示，與Sham組Cr濃度和BUN相比，IRI組Cr濃度和BUN極顯著增高（P<0.01和P<0.001）。不同EGCG濃度組的Cr濃度和BUN濃度分別為(90.75±8.73)、(65.74±5.77)、(38.65±4.78)μmol·L-1和(55.17±3.51)、(41.58±2.44)、(28.36±1.38)mmol·L-1，EGCG組與IRI組相比，肌酐和尿素氮均顯著降低（P<0.05）。結(jié)果提示EGCG預(yù)處理可以呈濃度依賴性減輕腎缺血再灌注損傷，其最佳濃度為40 mg·kg-1。

2.2 EGCG減輕腎結(jié)構(gòu)的改變

在IRI組，腎臟損傷主要以腎小管損傷為主，腎小管損傷主要位于外髓部，典型的病理改變表現(xiàn)為：腎小管擴(kuò)張，腎小管細(xì)胞腫脹，空泡變性，壞死，刷狀緣的脫落，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤等損傷評(píng)分明顯增高（5±0.5）分，與Sham組（1±0.5）分相比有極顯著差異（P<0.01）。EGCG組與IRI組相比，最佳濃度的EGCG處理組腎小管擴(kuò)張，腎小管細(xì)胞腫脹，空泡變性，壞死，刷狀緣的脫落，腎間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤均明顯減少，其腎組織病理結(jié)構(gòu)損傷評(píng)分（2±0.5）分與IRI組相比明顯減輕（P<0.05）。結(jié)果顯示，EGCG預(yù)處理能明顯減輕腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎臟結(jié)構(gòu)改變，見圖1，表2。

表1　EGCG預(yù)處理對(duì)腎缺血再灌注損傷的影響Table 1 Effect of EGCG on the renal ischemia reperfusion injury

表2　EGCG對(duì)腎組織病理改變影響Table 2 Effect of EGCG on the renal pathological changes

2.3 EGCG抑制Wnt3a/β-catenin/p53信號(hào)通路激活

與Sham組相比，IRI組Wnt3a、β-catenin、p53、p21和細(xì)胞核中的b-catenin表達(dá)極顯著增高（P<0.05或P<0.001），而胞漿中的b-catenin表達(dá)明顯減少，且與Sham組相比達(dá)顯著（P<0.05）。與IRI組相比，EGCG組Wnt3a、β-catenin、p53、p21顯著減少（P<0.05），細(xì)胞核中的β-catenin表達(dá)極顯著減少（P<0.001），而胞漿中的b-catenin表達(dá)明顯增高（P<0.05）（圖2）。

2.4 EGCG減少TNF-α、IFN-γ和IL-6的表達(dá)

與Sham組相比，IRI組促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6水平顯著或極顯著增高（P<0.05或P<0.01)，EGCG組與IRI組相比，促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-6表達(dá)水平顯著或極顯著降低（P<0.05或P<0.01)，見圖3。

2.5 EGCG預(yù)處理減少M(fèi)DA含量

與Sham組相比，IRI組MDA含量極顯著增高（P<0.001），但EGCG組與IRI組相比，MDA含量顯著降低（P<0.05），見表3。

圖1　EGCG預(yù)處理對(duì)腎缺血再灌注損傷導(dǎo)致的腎組織病理改變影響（400×）Fig.1 The effect of EGCG pretreatment on pathological changes in renal ischemia reperfusion injury(400×)

圖2　WB檢測(cè)EGCG預(yù)處理對(duì)Wnt3a、β-catenin、p53、p21、細(xì)胞核和細(xì)胞漿中的β-catenin 蛋白表達(dá)的影響Fig.2 The effect of EGCG pretreatment on the expression of Wnt3a,β-catenin,p53,p21,β-catenin in the cytoplasm and nucleus by WB analysis

圖3　RT-PCR和ELISA檢測(cè)EGCG預(yù)處理對(duì)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、FN-γ、IL-6表達(dá)的影響Fig.3 The effect of EGCG pretreatment on the expression of TNF-α,IFN-γ and IL-6 by RT-PCR and ELISA

2.6 EGCG預(yù)處理增加CAT、GPx和SOD的含量

與Sham組相比，IRI組CAT、GPx和SOD含量極顯著降低（P<0.01），但EGCG組與IRI組相比，CAT、GPx和SOD的活性顯著增高（P<0.05）（表4）。

表3　TBA法檢測(cè)EGCG預(yù)處理對(duì)MDA含量的影響Table 3 The effect of EGCG pretreatment on the expression of MDA examined by TBA

表4　EGCG預(yù)處理對(duì)腎臟中CAT、GPx、SOD、MDA表達(dá)的影響Table 4 The effect of EGCG pretreatment on the renal expression of CAT,GPx and SOD

3 討論

急性腎功能衰竭是臨床上常見的危急重癥，腎缺血再灌注損傷是急性腎損傷常見的致病原因，常繼發(fā)于腎移植、心臟體外循環(huán)手術(shù)、休克等，其發(fā)病率高，預(yù)后差[1-3]。目前尚缺有效的治療措施。目前研究發(fā)現(xiàn)腎缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制涉及炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激等[1-3]。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腎缺血再灌注損傷可誘導(dǎo)促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IFN-γ和促氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA表達(dá)增高，而抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物CAT、GPx、SOD表達(dá)明顯降低，及引起腎臟病理改變和腎臟失功。這進(jìn)一步證實(shí)了炎癥和氧化應(yīng)激是引起腎缺血再灌注損傷的重要原因[1-3]，因此抑制炎癥和氧化應(yīng)激是減輕腎缺血再灌注損傷的有效途徑。

表沒食子兒茶素沒食子酸酯是綠茶的主要活性成分，最近研究發(fā)現(xiàn)其具有多重生物學(xué)活性，如抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤等[5-6]?？蓽p輕腸、腦、心臟缺血再灌注損傷，而對(duì)腎臟缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制尚不清楚[9-11]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示EGCG預(yù)處理可明顯減輕促炎癥細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IFN-γ和促氧化應(yīng)激產(chǎn)物MDA表達(dá)，而上調(diào)抗氧化應(yīng)激產(chǎn)物CAT、GPx和SOD，進(jìn)而減輕腎臟病理改變和腎臟失功。這提示EGCG可通過抗氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)減輕腎缺血再灌注損傷。但對(duì)EGCG抑制氧化應(yīng)激和炎癥的具體機(jī)制不清。

p53作為一種重要的信號(hào)通路蛋白，在缺血再灌注損傷可介導(dǎo)炎癥、氧化應(yīng)激、凋亡等，其定向靶向產(chǎn)物為p21[12-13]，而Wnt/β-catenin信號(hào)通路可調(diào)節(jié)其活性。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)腎缺血再灌注損傷可促進(jìn)Wnt3a、β-catenin、p53、p21的表達(dá)，而EGCG預(yù)處理可減少Wnt3a、β-catenin、p53和p21的表達(dá)。因此試驗(yàn)結(jié)果提示EGCG可抑制Wnt3a/β-catenin/p53信號(hào)途徑激活，并減輕炎癥和氧化應(yīng)激，對(duì)腎缺血再灌注損傷具有一定的保護(hù)作用。

綜上所述，EGCG減輕腎缺血再灌注損傷與抑制Wnt3a/β-catenin/p53信號(hào)通路介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激相關(guān)。但是EGCG是直接作用于Wnt3a信號(hào)分子還是通過調(diào)節(jié)其上游激酶和/或信號(hào)分子而間接發(fā)揮作用仍不清楚，除Wnt3a信號(hào)通路外，是否還有其他信號(hào)通路涉及EGCG抑制炎癥和氧化應(yīng)激，尚需進(jìn)一步更深入的研究。

參考文獻(xiàn)

[1]Shen H,Kreisel D,Goldstein DR.Processes of sterile inflammation[J].Journal of immunology,2013,191(6):2857-2863.

[2]Kalyanaraman B.Teaching the basics of redox biology to medical and graduate students:Oxidants,antioxidants and disease mechanisms[J].Redox biology,2013,1(1):244-257.[3]Kusch A,Hoff U,Bubalo G,et al.Novel signalling mechanisms and targets in renal ischaemia and reperfusion injury[J].Acta Physiol,2013,208(1):25-40.

[4]Wang Y,He J,Pei X,et al.Systematic review and meta-analysis of mesenchymal stem/stromal cells therapy for impaired renal function in small animal models[J].Nephrology,2013,18(3):201-208.

[5]Pae M,Wu D.Immunomodulating effects of epigallocatechin-3-gallate from green tea:mechanisms and applications[J].Food & Function,2013,4(9):1287-1303.

[6]Camfield DA,Stough C,Farrimond J,et al.Acute effects of tea constituents L-theanine,caffeine,and epigallocatechin gallate on cognitive function and mood:a systematic review and meta-analysis[J].Nutr Rev,2014,72(8):507-522.

[7]Lv J,Feng M,Zhang L,et al.Protective effect of epigallocatechin gallate,a major constituent of green tea,against renalischemia-reperfusion injury in rats[J].Int Urol Nephrol,2015,47(8):1429-1435.

[8]Legeay S,Rodier M,Fillon L,et al.Epigallocatechin gallate:a review of its beneficial properties to prevent metabolic syndrome[J].Nutrients，2015,7(7):5443-5468.

[9]Takizawa Y,Kitazato T,Kishimoto H,et al.Effects of antioxidants on drug absorption in in vivo intestinal ischemia/reperfusion[J].Eur J Drug Metab Pharmacokinet,2011,35(3/4):89-95.

[10]Zhang F,Li N,Jiang L,et al.Neuroprotective Effects of(-)-epigallocatechin-3-gallate against focal cerebralischemia/reperfusion injury in rats through attenuation of inflammation[J].Neurochem Res,2015,40(8):1691-1698.

[11]Lee SK,Kim JH,Kim JS,et al.Polyphenol(-)-epigallocatechin gallate-induced cardioprotection may attenuate ischemia-reperfusion injury through adenosine receptor activation:a preliminary study[J].Korean J Anesthesiol,2012,63(4):340-345.

[12]Vaseva AV,Moll UM.The mitochondrial p53 pathway[J].Biochim Biophys Acta,2009,1787(5):414-420.

[13]Miura T,Nishihara M,Miki T.Drug development targeting the glycogen synthase kinase-3beta(GSK-3beta)-mediated signal transduction pathway:role of GSK-3beta in myocardial protection against ischemia/reperfusion injury[J].J Pharmacol Sci,2009,109(2):162-167.

[14]Xia Y,He Z,Liu B,et al.Downregulation of Meg3 enhances cisplatin resistance of lung cancer cells through activation of the Wnt/β-catenin signaling pathway[J].Mol Med Rep,2015,12(3):4530-4537.

[15]Szlachcic WJ,Switonski PM,Krzyzosiak WJ,et al.Huntington disease iPSCs show early molecular changes in intracellular signaling,the expression of oxidative stress proteins and the p53 pathway[J].Dis Model Mech,2015,8(9):1047-1057.

The Investigation of the Protection Effects and Mechanism of EGCG on Kidney Ischemia Reperfusion Injury

LIU Hongguo
Department of Human Anatomy,Weifang Medical University,Weifang 261053,China

Abstract:The study aims to investigate potential protection and mechanism of epigallocatechin gallate（EGCG） on kidney ischemia reperfusion injury.The results showed that EGCG treatment improved renal dysfuction,pathlogical change of kidney tissues,and reduced the expression of Wnt3a,b-catenin,MDA,IL-6,IFN-g and TNF-a,but increased the levels of CAT,GPXand SOD,suggesting that EGCG can protect the kidney from ischemia-reperfusion injury in rats which is associated with suppressing the activation of Wnt/b-catenin/p53 signaling pathway and inhibiting inflammation and oxidative stress.

Keywords:EGCG,kidney ischemia reperfusion injury,inflammation,oxidative stress,Wnt/b-catenin

作者簡介：劉洪國：男，講師，主要從事人體解剖學(xué)教學(xué)和研究，E-mail:109342196@qq.com

收稿日期：2015-08-06

修訂日期：2015-10-13

中圖分類號(hào)：TS272；Q946.84+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-369X（2016）02-169-06