王晨，呂世懂，廉明，孟慶雄*.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；.昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，云南 昆明 6508

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頂空固相微萃取結(jié)合GC/MS分析普洱大葉種喬木茶花香氣成分

王晨1，呂世懂2，廉明1，孟慶雄1*
1.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.昆明市糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)中心，云南 昆明 650118

摘要：運(yùn)用全自動(dòng)頂空固相微萃取技術(shù)（Headspace solid-phase microextraction，HS-SPME）對(duì)云南普洱地區(qū)生產(chǎn)的大葉種喬木茶花樣品中的揮發(fā)性成分進(jìn)行提取，并采用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)（Gas chromatography-mass spectrometry,GC/MS）進(jìn)行定性定量分析；同時(shí)與該類(lèi)茶樹(shù)制成的普洱生茶的揮發(fā)性成分進(jìn)行了比較。結(jié)果表明，從普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶中鑒定出揮發(fā)性成分分別為9種和67種，主要以碳?xì)浠衔锖痛碱?lèi)揮發(fā)性化合物為主。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，普洱大葉種喬木茶花中的揮發(fā)性成分均存在于普洱生茶的揮發(fā)性成分之中，這些成分均具有一定香氣特性。本研究表明，普洱大葉種喬木茶花可作為獨(dú)立飲品，有類(lèi)似于茶葉的香味感受，或者可與茶葉混合以提高或改善茶葉產(chǎn)品的香氣風(fēng)味。

關(guān)鍵詞：茶花；普洱生茶；頂空固相微萃?。℉S-SPME）；揮發(fā)性成分；氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）

云南具有適宜茶樹(shù)生長(zhǎng)的得天獨(dú)厚的氣候環(huán)境和地理?xiàng)l件，全省茶園面積超過(guò)570萬(wàn)畝[1]，居全國(guó)第二，茶花產(chǎn)量巨大，但其基礎(chǔ)研究及市場(chǎng)開(kāi)發(fā)都還處于起步階段。目前，關(guān)于茶樹(shù)花的研究主要集中在茶花中的多糖方面[2]。其醫(yī)用功效表現(xiàn)在治療出血、便血、涼血解毒等癥狀[3]。在茶花的應(yīng)用方面，采摘立秋之后的茶花，經(jīng)干燥晾曬，單獨(dú)壓制成茶花餅或與秋季的曬青毛茶（生茶）混和后壓制成的餅茶，市面上稱(chēng)這種含普洱茶花的普洱茶為谷花茶，該茶口感純正，味道清淡，香味如荷[4]。此外，茶花還可以作為輔助成分制作糕點(diǎn)。

普洱大葉種喬木茶花，因其營(yíng)養(yǎng)成分和活性物質(zhì)相當(dāng)豐富，具有很大的開(kāi)發(fā)和利用價(jià)值，例如普洱大葉種喬木茶花中的天然多糖具有增強(qiáng)免疫、抗病毒、抗氧化等多種生物活性功效[5]。梅花、杜鵑、茉莉花心、山茶茶花、梔子花和薔薇等的揮發(fā)性成分有過(guò)研究[6-7]，對(duì)普洱大葉種喬木生茶的揮發(fā)性成分也有較多報(bào)道[8-11]，但對(duì)普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性成分的研究卻未見(jiàn)報(bào)道。

目前，頂空固相微萃取法已經(jīng)在不同類(lèi)型茶葉揮發(fā)性組分的提取中被廣泛應(yīng)用[12-14]。它是一種靈敏度高、簡(jiǎn)單、重現(xiàn)性好、可靠的樣品前處理技術(shù)，而且在整個(gè)提取過(guò)程中不使用任何有機(jī)溶劑，可以真實(shí)地反映茶葉樣品中所含的化學(xué)信息。運(yùn)用全自動(dòng)頂空固相微萃取法集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，通過(guò)軟件全自動(dòng)控制整個(gè)萃取過(guò)程，樣品的處理時(shí)間大大縮短，實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)性和準(zhǔn)確性得到了明顯提高[15]。

本文以普洱大葉種喬木茶花為研究對(duì)象，對(duì)其揮發(fā)性成分進(jìn)行分離鑒定，并比較它與大葉種曬青毛茶（生茶）在揮發(fā)性成分上的差異性，旨在探究普洱大葉種喬木茶花的理化特性，為將茶花及普洱茶進(jìn)一步開(kāi)發(fā)茶葉新產(chǎn)品提供科學(xué)依據(jù)及理論參考。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

普洱大葉種喬木干茶花和普洱生茶，2013年產(chǎn)于普洱市梅子湖茶園，由普洱市茶業(yè)局提供。茶樹(shù)品種為小喬木過(guò)渡型野生茶樹(shù)，屬推廣品種，樹(shù)齡20年，樹(shù)高經(jīng)修剪后為1.5 m，于立秋采摘該茶花樣品，開(kāi)放程度為盛花，然后經(jīng)自然曬干處理。混合標(biāo)準(zhǔn)品為正構(gòu)烷烴C6～C30（美國(guó)AccuStandard公司）。

1.2 主要儀器

7890A氣相色譜5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫公司）；G6500轉(zhuǎn)盤(pán)式自動(dòng)進(jìn)樣器（美國(guó)CTC公司）；配置有65 μm PDMS/DVB萃取頭的固相微萃取裝置（美國(guó)Supelco公司）；BP210S電子分析天平（德國(guó)塞多利斯公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)與方法[16-17]

1.3.1 頂空固相微萃取

首先對(duì)萃取頭進(jìn)行預(yù)處理，將65 μm PDMS/DVB萃取纖維在氣相色譜進(jìn)樣口250℃條件下老化60 min。然后通過(guò)粉碎機(jī)粉碎茶葉或茶花樣品，并快速稱(chēng)取各2.00 g的樣品裝入20 mL密閉的小瓶中，加入5 mL沸騰蒸餾水進(jìn)行沖泡，并立即密閉瓶口。然后，在80℃平衡10 min進(jìn)行固相微萃取，吸附60 min，最后解吸附3.5 min，每個(gè)樣品重復(fù)2次。

1.3.2 GC/MS檢測(cè)

氣相色譜條件：色譜柱采用HP-5MS彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度為250℃，載氣為高純氦氣，1 mL·min-1的流速進(jìn)行不分流進(jìn)樣；程序升溫：保持5 min 的50℃初始柱溫，以3℃·min-1的速度升至210℃，平衡3 min，然后再以15℃·min-1的速度升至230℃。

質(zhì)譜條件：電離方式為EI，電子能量70 eV，離子源溫度為230℃，接口溫度為280℃，電子倍增器電壓為350 V，35～400 m/z進(jìn)行質(zhì)量掃描，2.8 min溶劑延遲。

1.3.3 保留指數(shù)值測(cè)定

取正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品，按照1.3.2的條件進(jìn)行GC/MS分析（進(jìn)樣量1 μL），記錄每個(gè)正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品出峰的保留時(shí)間，采用Kovats保留指數(shù)（Retention index，RI）公式計(jì)算各組分的RI值：

式中，tx、tn和tn+1分別表示分析組分、n碳原子數(shù)和n+1碳原子數(shù)之間的正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品（tn

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用安捷倫MSD G1701EA E.02.00.493化學(xué)工作站處理系統(tǒng)，并將GC/MS分析得到的數(shù)據(jù)在NIST 08.L標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)上進(jìn)行檢索，然后將計(jì)算出來(lái)的RI值與文獻(xiàn)中用HP-5MS柱測(cè)得的RI值進(jìn)行比較[18-20]，最佳鑒定結(jié)果以質(zhì)譜相似度和RI值接近度最高的化學(xué)結(jié)構(gòu)為準(zhǔn)，無(wú)法得到保留指數(shù)的仍以質(zhì)譜匹配度最高為準(zhǔn)。同時(shí)，運(yùn)用峰面積歸一化法進(jìn)行定量分析，得到各組分的相對(duì)含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性成分分析

普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性成分的GC/MS總離子流色譜圖分別如圖1和圖2所示，它們揮發(fā)性成分的定性和定量結(jié)果分別如表1和表2所示。

圖1　普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性成分GC-MS總離子流色譜圖Fig.1 GC-MS total ion chromatogram of volatile components in big-leaf tea plant(Camellia sinensis var.assamica)flower

在普洱大葉種喬木茶花中，共鑒定出揮發(fā)性成分9種，主要為碳?xì)浠衔?0.42%（6種）、酮類(lèi)16.59%（2種）、以及醇類(lèi)10.31% （1種）。碳?xì)浠衔镏饕鞘椋?.21%）、D-檸檬烯（3.66%）和芳香烴類(lèi)48.55%（4種）；酮類(lèi)組分主要是香葉基丙酮（6.69%）和β-紫羅酮（9.90%）；芳香烴類(lèi)主要是萘（29.90%）、蒽（8.66%）、芴（5.31%）和1-甲基萘（4.68%）；醇類(lèi)是脫氫芳樟醇（10.31%）。

在普洱生茶中，共鑒定出揮發(fā)性成分67種，主要為醇類(lèi)33.25%（17種）、碳?xì)浠衔?2.11%（25種，其中芳香烴類(lèi)10種，占6.74%）、酮類(lèi)12.69%（8種）、酯類(lèi)8.21%（4種）、、含氮化合物5.24%（2種）、內(nèi)酯類(lèi)4.00% （1種）、雜氧化合物4.70%（3種）、酸類(lèi)2.48% （1種）、醛類(lèi)1.8%（5種）和酚類(lèi)化合物0.17% （1種）。醇類(lèi)組分中主要以芳樟醇（11.47%）、植醇（8.3%）、香葉醇（2.95%）以及橙花叔醇（1.84%）為主，這幾種物質(zhì)占總醇類(lèi)物質(zhì)的73.86%；碳?xì)漕?lèi)主要是2,6,10,14-四甲基十五烷（3.17%）、十六烷（2.25%）以及芳香烴類(lèi)中的芴（1.67%）和1,2,3-三甲氧基苯（1.5%）；不飽和烴化合物主要是α-法呢烯（1.9%）和β-蒎烯（0.73%）；酮類(lèi)組分主要是香葉基丙酮（3.87%）、β-紫羅酮（3.83%）和植酮（2.52%）；酯類(lèi)化合物主要是十六烷酸甲酯（5.13%）和水楊酸甲酯（2.19%）；含氮化合物主要是咖啡堿（4.70%）；內(nèi)酯類(lèi)揮發(fā)性化物中僅檢測(cè)出二氫獼猴桃內(nèi)酯（4.00%）；雜氧化合物主要是芳樟醇氧化物Ⅲ（0.94%）、芳樟醇氧化物Ⅱ（2.06%）和芳樟醇氧化物Ⅰ（1.70%）；酸類(lèi)化合物僅檢出十六烷酸（2.48%）；醛類(lèi)主要是β-環(huán)檸檬醛（0.85%）；酚類(lèi)是2,6-二甲氧基苯酚（0.17%）。

圖2　普洱生茶揮發(fā)性成分GC/MS總離子流色譜圖Fig.2 GC/MS total ion chromatogram of volatile components in the Pu-erh raw tea

表1　普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性成分的GC/MS分析結(jié)果Table 1 GC/MS analysis results of volatile components in big-leaf tea plant(Camellia sinensis var.assamica)flower

表2　普洱生茶揮發(fā)性成分的GC/MS分析結(jié)果Table 2 GC/MS analysis results of volatile components in the Pu-erh raw tea

續(xù)表2

2.2 普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性組分對(duì)比分析

普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶的香氣成分分析比較結(jié)果見(jiàn)表3，這兩種樣品的香氣成分相對(duì)含量比較見(jiàn)圖3。從圖表中可以看出，普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶揮發(fā)性成分都以醇類(lèi)和碳?xì)浠衔餅橹?，但是普洱大葉種喬木茶花中碳?xì)浠衔锩黠@相對(duì)含量很高（60.42%），除碳?xì)漕?lèi)、醇類(lèi)和酮類(lèi)化合物外并沒(méi)有檢測(cè)出其他揮發(fā)性成分。普洱生茶檢出67種，其碳?xì)漕?lèi)揮發(fā)性化合物與普洱大葉種喬木茶花相比明顯相對(duì)含量較低，但其醇類(lèi)化合物相對(duì)含量與普洱大葉種喬木茶花相近。此外，通過(guò)表1和表2可以發(fā)現(xiàn)，鑒定出的普洱大葉種喬木茶花揮發(fā)性組分全部存在于云南普洱生茶的揮發(fā)性組分中，共有9種，分別為D-檸檬烯、芴、蒽、萘、十六烷、脫氫芳樟醇、香葉基丙酮、1-甲基萘和β-紫羅酮。在茶花所鑒定出的揮發(fā)性組分中，D-檸檬烯具有檸檬香味，甜、柑橘的果皮香韻[21]；脫氫芳樟醇具有花的甜清香，香氣具有柔和持久的特點(diǎn)[22]；香葉基丙酮具有葉香、玫瑰香和果香[23]；而β-紫羅酮具有柏木香和紫羅蘭香等特殊香氣[16]。若茶花與普洱生茶混配制作谷花茶，這些物質(zhì)有助于增加生茶的原始香味，可在一定程度上提高生茶的香氣感受。此外，直接沖泡飲用普洱茶花，香味感受與生茶相近，滋味醇厚，具有板栗香，可作為新的飲品開(kāi)發(fā)。

2.3 方法的重現(xiàn)性

HS-SPME結(jié)合GC/MS分析測(cè)定普洱大葉種喬木茶花和普洱生茶香氣成分的方法重現(xiàn)性是十分重要的指標(biāo)之一。按照1.3.1處理本實(shí)驗(yàn)中的茶葉和茶花樣品5次，分別用1.3.2的條件進(jìn)行GC/MS檢測(cè)分析，以檢測(cè)比較總峰面積和保留時(shí)間為主。結(jié)果表明，總峰面積和保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）都符合分析要求（RSD<3%）。由于樣品揮發(fā)性組分濃度會(huì)隨著頂空萃取次數(shù)的增加而下降，進(jìn)而總峰面積和實(shí)驗(yàn)結(jié)果會(huì)受到一定影響，所以同一份樣品只能進(jìn)行1次HS-SPME分析。

表3　2種樣品揮發(fā)性成分分析比較結(jié)果Table 3 The comparison results of two kinds of samples by aromatic components analysis

圖3　兩種樣品香氣組分對(duì)比圖Fig.3 Comparison of aromatic compounds in two kinds of samples

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在普洱生茶樣品中檢測(cè)出較高含量的芳樟醇及其氧化物、二氫獼猴桃內(nèi)酯、水楊酸甲酯、α-松油醇、香葉醇、植醇等揮發(fā)性香氣物質(zhì)，而且其他學(xué)者也從普洱生茶中檢測(cè)出了含量較高的這些化合物[24]，并猜測(cè)這些物質(zhì)對(duì)普洱生茶的典型木香和青草香味起到了一定的作用。其中，芳樟醇含量高達(dá)11.47%，張峻松等[25]認(rèn)為其香氣新鮮純正持久，對(duì)普洱生茶的風(fēng)味具有重要影響。特別是，具有鮮葉香氣的二氫獼猴桃內(nèi)酯和具有木香的萜烯類(lèi)化合物被認(rèn)為是普洱生茶中的主要香氣成分之一[26]，因此其含量也很高，我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與這一猜測(cè)相吻合，這兩種物質(zhì)的產(chǎn)生估計(jì)與茶葉的殺青程度有關(guān)。此外，楊明容等[27]認(rèn)為水楊酸甲酯具有特殊的香氣和滋味，黃致喜等[28]認(rèn)為α-松油醇、香葉醇、植醇是一種良好的定香溶劑，它們的產(chǎn)生對(duì)茶香的貢獻(xiàn)還需要結(jié)合先進(jìn)的GC-O等儀器作進(jìn)一步地判斷。

通過(guò)對(duì)普洱大葉種喬木茶花和對(duì)應(yīng)的生茶揮發(fā)性成分的探究，旨在加深對(duì)茶花理化特性的了解。此次研究從茶花中所鑒定出來(lái)的揮發(fā)性組分較少，可能與我們使用的萃取方式和茶花干燥方式有關(guān)。頂空固相微萃取（HS-SPME）是一種無(wú)溶劑的樣品前處理技術(shù)，對(duì)于分析茶葉以及相關(guān)樣品具有良好的表現(xiàn)[29]，但對(duì)于茶花樣品尚未充分優(yōu)化，這可能導(dǎo)致了茶花的揮發(fā)性成分在一定程度上沒(méi)有揮發(fā)完全。因此，還應(yīng)該進(jìn)一步結(jié)合同時(shí)蒸餾萃取法或其他方法進(jìn)行檢測(cè)分析，全面考察茶花中的揮發(fā)性成分。

揮發(fā)性組分帶來(lái)的香氣感受是反映茶葉品質(zhì)和特征的一個(gè)重要因素之一，另一方面則是水溶性物質(zhì)帶來(lái)的滋味感受[30]。目前，將茶花摻到普洱生茶中，可以使茶葉的滋味變得更加甘甜和醇厚。但這缺乏實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持，僅僅是從感官角度出發(fā)，具有較強(qiáng)的主觀意識(shí)。因此，基于分光光度法及液相色譜技術(shù)及液質(zhì)聯(lián)用的茶花化學(xué)成分的研究也應(yīng)當(dāng)進(jìn)一步考慮。同時(shí)還可結(jié)合普洱茶花優(yōu)良的品質(zhì)和藥理學(xué)功效進(jìn)行深加工，開(kāi)發(fā)相應(yīng)的功能飲料?？傊?，通過(guò)比較云南普洱大葉種喬木茶花和對(duì)應(yīng)的生茶揮發(fā)性成分，能夠?yàn)槠斩笕~種喬木茶花及普洱谷花茶的市場(chǎng)開(kāi)發(fā)及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供科學(xué)依據(jù)和理論參考。

4 結(jié)論

本研究首次通過(guò)全自動(dòng)頂空固相微萃?。℉S-SPME）結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜（GC/MS）法分析普洱大葉種喬木茶花茶香氣成分，并與普洱生茶香氣成分進(jìn)行比較，從中分別鑒定出香氣成分9種和67種，結(jié)果表明它們的香氣成分都以醇類(lèi)、酮類(lèi)、碳?xì)漕?lèi)揮發(fā)性化合物為主，普洱大葉種喬木茶花中所鑒定出來(lái)的揮發(fā)性組分較少。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，普洱大葉種喬木茶花中的揮發(fā)性成分均存在于普洱生茶的揮發(fā)性成分之中，這些成分均具有一定香氣特性。本研究表明，茶花作為獨(dú)立飲品有類(lèi)似于茶葉的香味感受，或者可與茶葉混合以提高或改善茶葉產(chǎn)品的香氣風(fēng)味。

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Analysis of Aroma Components in Big-leaf Tea Plant(Camellia sinensis var.assamica)Flower Using Headspace Solid-phase Microextraction Coupled with GC/MS

WANG Chen1,Lü Shidong2,LIAN Ming1,MENG Qingxiong1*

1.Faculty of Life Science and Technology,Kunming University of Science and Technology,Kunming 650500,China; 2.Kunming Grain and Oil and Feed Product Quality Inspection Center,Yunnan 650118,China

Abstract:The volatile components of tea flower(Camellia sinensis var.assamica),which was collected from tea garden in Pu-erh district,were extracted by fully automated headspace solid-phase microextraction(HS-SPME),identified by gas chromatography-mass spectrometry(GC/MS),and compared with the volatile components of Pu-erh green tea from same tea garden.The results showed that 9 and 67 kinds of volatile components were identified in tea flower and Pu-erh raw tea,respectively.Among them,hydrocarbons and alcohols were two major volatile components.Comparison showed that all volatile components of the tea flower were also found in Pu-erh green tea.Our results suggests that the tea flower may have similar aroma to tea leaves,and can also be mixed with tea leaves to improve the aromatic flavor.

Keywords:tea flower,Pu-erh raw tea,HS-SPME,volatile components,GC/MS

作者簡(jiǎn)介：王晨，男，碩士研究生，主要從事生物工程方面的研究。*通訊作者：qxmeng@sina.com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（31460228）。

收稿日期：2015-08-13

修訂日期：2015-10-13

中圖分類(lèi)號(hào)：TS272；Q946.8

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1000-369X（2016）02-175-09