賈維寶，劉良忠，黃　婷，曹宇翔，朱　哲，李文杰

(武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023)

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幾種用于肽粉中蛋白質(zhì)含量測定方法的比較

賈維寶，劉良忠，黃婷，曹宇翔，朱哲，李文杰

(武漢輕工大學 食品科學與工程學院，湖北 武漢 430023)

摘要：考慮到生產(chǎn)實際，為了找到一種準確，簡便的測定市售肽粉中蛋白質(zhì)含量的方法，實驗以凱氏定氮法為參考，通過對雙縮脲法，福林酚法，考馬斯亮藍法，紫外吸收法測定不同分子質(zhì)量段的肽粉中蛋白質(zhì)含量的比較，篩選出測定肽粉中蛋白質(zhì)含量的最適方法。結果分析表明：用雙縮脲法測定的肽粉中蛋白質(zhì)含量最接近于凱氏定氮法，結果準確，操作簡單，且適用于小分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)的測定。

關鍵詞：肽粉；蛋白質(zhì)測定；方法比較

1引言

蛋白質(zhì)是構成生物體細胞組織的重要成分，食物中的蛋白質(zhì)是人體中氮的唯一來源，具有糖類和脂肪不可替代的作用[1]。蛋白質(zhì)的測定方法一般可分為間接方法和直接方法。間接方法是通過測定樣品中蛋白質(zhì)的含氮量進行推算蛋白質(zhì)含量的方法；直接方法則是根據(jù)蛋白質(zhì)的物理和化學性質(zhì)，直接測定蛋白質(zhì)含量的方法[2]。蛋白質(zhì)含量測定法，目前包括定氮法[3]，雙縮脲法[4]，福林酚法(Lowry法)，紫外吸收法[5]和考馬斯亮藍法[6]。凱氏定氮法較復雜，但準確，往往以凱氏定氮法測定的蛋白質(zhì)作為其他方法的標準蛋白質(zhì)[7-8]。

氨基酸彼此以酰胺鍵相互連接形成的化合物稱作肽，含10個以上氨基酸殘基(<50個)的肽通常被稱為多肽，而含10個以下的稱為寡肽(低聚肽，小肽，短肽)，低聚肽的相對分子質(zhì)量一般較低，通常在1 000 Da以下。肽是由氨基酸組成的聚合物，主要來自于蛋白質(zhì)合成或分解的中間產(chǎn)物， 其具有良好的加工特性、營養(yǎng)功能和生理活性。

為了方便研究人員對市場上銷售的肽粉中蛋白質(zhì)含量進行快速檢測，實驗以凱氏定氮法做參考，考察用雙縮脲法、福林酚法、紫外吸收法和考馬斯亮藍法測定肽粉中蛋白質(zhì)含量的準確性及適用性，篩選出最簡便、快捷的檢測方法。

2實驗材料與方法

2.1實驗樣品

甲基紅：天津市科密歐化學試劑開發(fā)中心；溴甲酚綠：國藥集團化學試劑有限公司；牛血清清蛋白：北京天勤一和生物科技有限公司；酒石酸鉀鈉：天津市凱通化學試劑有限公司；考馬斯亮藍G-250：上海展云化工有限公司；福林酚試劑：天津百倫斯生物科技有限公司；蛋清肽粉(分子質(zhì)量<3 000)：實驗室自制；蛋清肽粉(分子質(zhì)量<1 000)：實驗室自制，其他試劑均為分析純。

2.2實驗儀器

可見分光光度計：尤尼柯儀器有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：鄭州科豐儀器設備有限公司；微量滴定裝置，定氮蒸餾裝置等。

2.3實驗方法

2.3.1微量凱氏定氮法

精密稱取蛋清肽凍干粉1.5 g于干燥潔凈的凱氏燒瓶中，加入6 g無水K2SO4，0.2 g CuSO4，20 mL H2SO4。先小火加熱待泡沫停止后加大火，保持液面微沸，直到溶液呈藍綠色透明時再繼續(xù)加熱0.5—1 h。冷卻后加水定容至100 mL，然后進行微量蒸餾和滴定。最后按照公式(1)計算樣品的蛋白質(zhì)含量，并做平行實驗，計算其平均值再進行分析。

(1)

式中：V—樣品滴定時消耗的標準HCl溶液體積(mL)；

V0—空白滴定時消耗的標準HCl溶液體積(mL)；

C—標準HCl溶液的摩爾濃度(mol/L)；

F—氮換算成蛋白質(zhì)的系數(shù)；

m—試樣的質(zhì)量(g) 。

2.3.2雙縮脲法的測定分析

取7支試管，分別加入0 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL，1.2 mL的10 mg/mL標準蛋白質(zhì)溶液，用水補足到1 mL，然后加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫(20—25 ℃)下放置30 min，于540 nm處進行比色測定，用未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照液。以蛋白質(zhì)含量為橫坐標，光吸收值為縱坐標繪制標準曲線。然后用上述同樣的方法測定不同濃度、不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關系，繪制標準曲線。并做平行實驗，計算其平均值再進行分析。

2.3.3福林酚法(Lowry法)的測定分析

取7支試管，分別加入0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL標準蛋白質(zhì)溶液(濃度為250 μg/mL)。用水補足到1.0 mL，然后每支試管加入5 mL試劑甲( 50份A與1份B混合，即為試劑甲。A液：10 g Na2CO3，2 g NaOH和0.25 g酒石酸鉀鈉 (KNaC4H4O6.4H2O)，溶解于500 mL蒸餾水中。B液：0.5 g硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100 mL蒸餾水中)，在旋渦混合器上迅速混合，于室溫放置10 min，再逐管加入0.5 mL福林酚試劑，立即混勻。然后在室溫下放置10 min，以未加蛋白質(zhì)溶液的第一支試管作為空白對照，于750 nm處測定各管中溶液的吸光度值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線。然后用上述同樣的方法，測定不同濃度，不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關系，繪制標準曲線。并做平行實驗，計算其平均值再進行分析。

2.3.4考馬斯亮藍法的測定分析

取7只試管分別加入0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.4 mL，0.6 mL，0.8 mL，1.0 mL濃度為100 μg/ mL牛血清清蛋白標準液，補充水到1.0 mL。然后每只試管加入5.0 mL考馬斯亮藍G-250試劑，搖勻放置5 min，在紫外—可見分光光度計595 nm處測定吸光值。然后以吸光值為縱坐標，牛血清清蛋白的濃度為橫坐標繪制標準曲線。然后用上述同樣的方法，測定不同濃度，不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關系，繪制標準曲線。并做平行實驗，計算其平均值再進行分析。

2.3.5紫外吸收法的測定分析

取7只試管分別加入0 mL，0.1 mL，0.2 mL，0.3 mL，0.4 mL，0.5 mL，0.6 mL的1.25 mg/mL牛血清蛋白標準溶液，加水至4 mL，在280 nm條件下測定其吸光值。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制出標準曲線。然后用上述同樣的方法測定不同濃度、不同分子質(zhì)量的蛋清肽粉的蛋白質(zhì)濃度與吸光度的線性關系，繪制標準曲線，并做平行實驗，計算其平均值再進行分析。

2.4不同蛋白質(zhì)測定方法測定蛋清肽蛋白含量的比較

取適量低分子質(zhì)量(<1 000)的蛋清肽凍干粉樣品分別配成質(zhì)量分數(shù)為3%，6%，9%的溶液，然后分別用凱氏定氮法，雙縮脲法，福林酚法，考馬斯亮藍法，紫外吸收法測定其中的蛋白質(zhì)含量，具體實驗操作分別參照2.3.1，2.3.2，2.3.3，2.3.4中的測定方法。最后對不同方法3次平行測定結果的平均值進行分析比較。

3結果分析

3.1不同蛋白測定方法對不同分子質(zhì)量蛋清肽粉中蛋白含量的測定

3.1.1雙縮脲法的測定分析

由圖1數(shù)據(jù)繪制標準曲線得：雙縮脲法測定的牛血清蛋白標準曲線方程為y = 0.0334x+0.1201(R2=0.9996)，蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)曲線方程為y=0.0274x+0.1591(R2=0.9922)，蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)曲線方程為y= 0.029x+ 0.1121(R2= 0.9948)，均有較好的線性關系，從而說明雙縮脲法適用于測定肽粉中的蛋白質(zhì)含量，也適用于小分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)的測定。

圖1　雙縮脲法比較不同肽粉蛋白含量

3.1.2福林酚法的測定分析

由圖2數(shù)據(jù)繪制標準曲線得到：牛血清蛋白標準曲線方程為y=0.0025x+0.217(R2=0.9989)，蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)曲線方程為y=0.0015x+0.2128(R2= 0.9953)，有較好的線性關系。而蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)蛋白含量與A750無線性關系，這可能與蛋清肽粉分子質(zhì)量較小有關。從而說明，對于小分子質(zhì)量的肽粉中蛋白質(zhì)含量的測定，福林酚法不適用。

圖2　福林酚法比較不同肽粉蛋白含量

3.1.3考馬斯亮藍法的測定分析

由圖3數(shù)據(jù)繪制考馬斯亮藍法的牛血清蛋白標準曲線方程為y=0.0052x+0.0143(R2=0.9958)，線性關系良好。而蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)和蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)蛋白含量與A595均無線性關系。從而表明考馬斯亮藍法不適用于肽粉中蛋白質(zhì)含量的測定。

圖3　考馬斯亮藍法比較不同肽粉蛋白含量

3.1.4紫外吸收法的測定分析

由圖4數(shù)據(jù)繪制標準曲線得到：紫外吸收法繪制的牛血清蛋白標準曲線方程為y=0.0011x-0.1103(R2=0.9901)，線性關系良好。而蛋清肽粉(分子量≤3 000 Da)和蛋清肽粉(分子量≤1 000 Da)蛋白含量與A280均無線性關系。從而表明紫外吸收法不適用于肽粉中蛋白質(zhì)含量的測定。

圖4　紫外吸收法比較不同肽粉蛋白含量

3.2不同蛋白質(zhì)測定方法測定低分子質(zhì)量肽粉蛋白含量的結果比較

由圖5可以看出：當?shù)头肿淤|(zhì)量蛋清肽凍干粉的質(zhì)量分數(shù)分別為3%，6%，9%時，雙縮脲法測定蛋清肽溶液中蛋白含量的值分別為23.6 mg/mL，43.94 mg/mL，68.57 mg/mL，最接近于凱氏定氮法的測定值23.64 mg/mL，47.16 mg/mL，71.33 mg/mL，其次是福林酚法的測定值20.8 mg/mL，35.75 mg/mL，58.69 mg/mL，紫外吸收法的測定值16.2 mg/mL，27.4 mg/mL，51.34 mg/mL，而考馬斯亮藍法測定值0.64 mg/mL，6.09 mg/mL，4.25 mg/mL，遠遠小于凱氏定氮法測定值，誤差較大。因此我們可以得出：凱氏定氮法和雙縮脲法是測定低分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)含量的最適方法。

圖5　不同蛋白質(zhì)測定方法測定肽粉的比較

4結論

從實驗中可以看出，凱氏定氮法是目前分析有機化合物含氮量最常用的方法，是一種蛋白質(zhì)測定的經(jīng)典方法，適用樣品廣泛，測試結果準確[6]，但是，操作較繁瑣，耗時長，不適合用于蛋白質(zhì)含量的快速測定。在對于低分子質(zhì)量的蛋清肽粉中蛋白質(zhì)含量的測定時，雙縮脲法所測得的結果和凱氏定氮法差距不大(當?shù)头肿淤|(zhì)量蛋清肽凍干粉的質(zhì)量分數(shù)為3%時，雙縮脲法測定的蛋白質(zhì)含量為23.23 mg/mL，凱氏定氮法測定值為23.64 mg/mL，誤差僅為1.73%，且操作簡單，快速，效果較好?？捡R斯亮藍法、福林酚法、紫外吸收法均不適用于小分子質(zhì)量肽粉中蛋白質(zhì)含量的測定。引起測定結果差異的原因可能是：紫外吸收法在測定與標準蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸含量差異較大的蛋白質(zhì)時，有一定的誤差且僅適用于測試無色樣品，對于有色樣品，需進行預處理，排除顏色干擾后才適用于此方法[9]。Folin-酚法對蛋白質(zhì)含量的測定會受到酚類、檸檬酸、硫酸銨、Tris緩沖液、甘氨酸，糖類、甘油等的干擾作用[10]?？捡R斯亮藍染色法快速、靈敏，但只對微量蛋白有較好的測定線性范圍，因此在實驗前必須將樣品的蛋白濃度稀釋至0.1—1 mg/mL，這對于未知蛋白濃度的樣品來說不易操作，而且實驗必須在1 h內(nèi)完成，否則測試結果不準確[11]。雙縮脲法對不同蛋白質(zhì)產(chǎn)生的顏色反應深淺相近，不受溫度影響，試劑單一，方法簡便，可快速測定蛋白質(zhì)含量。因此，雙縮脲法可以適用于不同分子質(zhì)量的肽粉中蛋白質(zhì)含量的快速檢測，而對于其的檢測限則可作為下一步的研究重點。

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Comparison of several methods for determinating the content of protein in peptides

JIAWei-bao,LIULiang-zhong,HUANGTing,CAOYu-xiang,ZHUZhe,LIWen-jie

(School of Food Science and Engineering，Wuhan Polytechnic University，Wuhan 430023，China)

Abstract：Taking into account the actual production,in order to find an accurate and simple method to determine the content of proten in peptides, the experiment was based on the method of kjeldahl determination, the comparison of the biuret method, Folin phenol method, coomassie blue staining, uv absorption method for determinating the content of protein in different molecular peptides to screening out the best method.Results show that the datas of biuret method are close to by kjeldahl determination. This method is very simple and accurate. And it also suitable to determination the protein in short peptides.

Key words：peptides, protein determination, method comparison

中圖分類號：Q 51

文獻標識碼：A

DOI:10.3969/j.issn.2095-7386.2016.01.004

文章編號：2095-7386(2016)01-0017-04

作者簡介:賈維寶(1989-)，男，碩士研究生，E-mail:15681901206@163.com.通信作者:劉良忠(1963-),男，教授，博士，E-mail：liu2022888@163.com.

收稿日期：2015-10-30.