龔　治， 張亞楠， 周世豪， 符悅冠*

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 海口 571101； 2農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 ?？?571101； 3海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 海口 570228

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甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)在生態(tài)學(xué)中的應(yīng)用

龔治1,2， 張亞楠3， 周世豪3， 符悅冠1,2*

1中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所，海南 ?？?571101；2農(nóng)業(yè)部熱帶作物有害生物綜合治理

重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 海口 571101；3海南大學(xué)環(huán)境與植物保護(hù)學(xué)院，海南 ?？?570228

摘要:DNA甲基化是生物體內(nèi)最為重要的表觀遺傳修飾形式之一，在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用越來越廣泛。在收集、整理生態(tài)表觀遺傳學(xué)相關(guān)文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，介紹了甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)的原理、優(yōu)勢與局限性及其在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用和展望。MSAP因其應(yīng)用廣泛、操作簡便等優(yōu)點(diǎn)成為研究DNA甲基化水平的有力工具，特別是在探究生物體如何快速適應(yīng)生境變化以及外來入侵生物如何突破遺傳瓶頸等問題上。MSAP技術(shù)能夠很好地揭示生物種群內(nèi)部或種群之間的表觀遺傳差異，是對(duì)遺傳多樣性、遺傳變異研究的有力補(bǔ)充。

關(guān)鍵詞:甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)； 生態(tài)學(xué)； 種群變異； 生態(tài)表觀遺傳學(xué)

隨著基因組時(shí)代的到來以及人們從基因水平對(duì)生物響應(yīng)外界環(huán)境的認(rèn)識(shí)，基因型與表型間的相互作用越來越被人們知曉。雖然多個(gè)物種的基因全序列信息已經(jīng)被公布，但有關(guān)基因組如何行使其功能并適應(yīng)復(fù)雜環(huán)境的研究進(jìn)展卻不大(Martinetal.,2011; Pigliucci,2010; Richardsetal.,2009、2012a)。生態(tài)表觀遺傳學(xué)(ecological epigenetics)是研究表觀遺傳差異和生態(tài)表型變異之間關(guān)系的學(xué)科。表觀遺傳機(jī)制的變化能夠改變基因表達(dá)和生物體功能，引起形態(tài)性狀上的差異(Cubasetal.,1999; Kucharskietal.,2008; Manningetal.,2006; Morganetal.,1999; Rakyanetal.,2003)，但不改變DNA序列(Richards,2006)。另外，研究發(fā)現(xiàn)，一些表觀遺傳標(biāo)記可被穩(wěn)定地遺傳給下一代(Jablonka & Raz,2009; Johannesetal.,2009; Verhoevenetal.,2010)，而表觀遺傳標(biāo)志在個(gè)體和種群中差異較大(Herrera & Bazaga,2010、2011; Herreraetal.,2012; Liuetal.,2012; Massicotte & Angers,2012; Massicotteetal.,2011; Richardsetal.,2012b; Schreyetal.,2012)。因此，表觀遺傳學(xué)機(jī)制是生物個(gè)體對(duì)其環(huán)境反應(yīng)機(jī)制的重要組成部分(Angersetal.,2010; Richardsetal.,2010; Verhoevenetal.,2010)。了解表觀遺傳差異將有助于解釋生態(tài)和進(jìn)化等方面的科學(xué)問題(Angersetal.,2010; Bossdorfetal.,2008; Richardsetal.,2008、2010)。

表觀遺傳機(jī)制(如DNA甲基化、染色體重編碼、組蛋白去乙酰化、位置效應(yīng)和小RNA干擾)可影響基因表達(dá)，其中DNA甲基化(DNA methylation)是研究較為充分的表觀遺傳機(jī)制。DNA甲基化通常是指一個(gè)甲基化的基團(tuán)被連接到胞嘧啶上，而該胞嘧啶后緊跟一個(gè)DNA序列中的鳥嘌呤(Bossdorfetal.,2010)。DNA甲基化對(duì)基因表達(dá)具有多種影響，通常表現(xiàn)為降低基因活性(Bossdorfetal.,2008; Jablonka & Lamb,2006)。目前已有多種技術(shù)(如HPLC、HPCE、重亞硫酸鹽測序法、甲基化熒光法)能檢測DNA甲基化的差異，其中甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)是最常用的方法(Reyna-Lópezetal.,1997)。本文就MSAP技術(shù)的原理、優(yōu)勢和局限性及其在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用進(jìn)行綜述和展望。

1MSAP原理

MSAP是一種基于AFLP技術(shù)檢測基因組甲基化變異的PCR技術(shù)(Reyna-Lópezetal.,1997)。該技術(shù)使用的限制性內(nèi)切酶MspⅠ和HpaⅡ?qū)ζ渥R(shí)別序列CCGG上的甲基化胞嘧啶具有不同的敏感性(Robertsetal.,2007)。HpaⅡ?qū)?條鏈上的內(nèi)外側(cè)胞嘧啶都甲基化及任一個(gè)胞嘧啶甲基化均不能酶切，即不能酶切含mCCGG、CmCGG和mCmCGG的位點(diǎn)，但可識(shí)別僅一條鏈上胞嘧啶被甲基化的位點(diǎn);而MspⅠ可識(shí)別單鏈或雙鏈上內(nèi)部胞嘧啶被甲基化，但不識(shí)別外部胞嘧啶被甲基化，即不能酶切含mCCGG的位點(diǎn)(McClellandetal.,1994; Robertsetal.,2007)?；诖?，可以將相同DNA序列擴(kuò)增出不同的譜帶，以此判斷DNA 5′-CCGG位點(diǎn)胞嘧啶的甲基化狀態(tài)和程度(Vosetal.,1995)。

2MSAP的優(yōu)勢

MSAP技術(shù)具有多方面的優(yōu)勢(Schreyetal.,2013)：(1)可用于研究非模式生物，甚至包括那些缺少基因組測序的物種;(2)技術(shù)上與AFLP技術(shù)相似，如具有相同的試驗(yàn)方案、技能和試驗(yàn)設(shè)備;(3)具有較好的成本效益，容易按比例增加，且相同試劑能夠用于不同的物種研究;(4)可在多個(gè)位點(diǎn)對(duì)大量個(gè)體進(jìn)行批量篩選，從而產(chǎn)生大量數(shù)據(jù)來檢測種群和處理中發(fā)生的突變與分化;(5)對(duì)環(huán)境誘導(dǎo)的DNA甲基化變異檢測靈敏度高。因此，盡管MSAP在結(jié)果推理上具有一定的局限性，但仍具有非常大的潛力。

3MSAP在生態(tài)學(xué)上的應(yīng)用

文獻(xiàn)檢索得知，近12年來在生態(tài)學(xué)領(lǐng)域共發(fā)表MSAP論文200多篇(圖1)，該領(lǐng)域的論文數(shù)量總體上呈逐年增加的趨勢，在2014年達(dá)到峰值(35篇)。值得注意的是，近年來除植物以外的以其他物種作為研究對(duì)象的論文數(shù)量也在不斷增加，如家麻雀Passerdomesticus(L.)(Schreyetal.,2012)、魯考弗美奇酵母菌Metschnikowiareukaufii(Pitt & M.W. Mill) (Herreraetal.,2012)、葉鼻蝠Hipposiderosarmiger(Hodgson) (Liuetal.,2012)等，表明MSAP技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域正不斷擴(kuò)大。

3.1MSAP與抗逆性研究

生物體在逆境條件下(如啃食、低溫、鹽、金屬離子等)，其DNA甲基化的水平和模式均會(huì)發(fā)生改變。Herrera & Bazaga (2011)以紫羅蘭Viosacazorlensis(Gand.)野生種群為對(duì)象，利用AFLP和MSAP技術(shù)研究取食對(duì)自然種群的遺傳和表觀遺傳特征的影響。發(fā)現(xiàn)個(gè)體中的DNA甲基化存在顯著差異，并與啃食程度相關(guān)；有些甲基化位點(diǎn)上的差異與特殊的AFLP標(biāo)記相關(guān)。該研究揭示了MSAP分析針對(duì)某一特定外界刺激的必要性。Xinetal.(2015)研究發(fā)現(xiàn)，低溫處理48 h后，馬鈴薯胞嘧啶甲基化水平從37.71%增加到56.51%，其甲基化模式的變化主要來自雙鏈DNA上CG的全甲基化；通過78個(gè)多態(tài)性DNA片段測序及半定量PCR檢測，發(fā)現(xiàn)與冷應(yīng)激相關(guān)的基因可以通過甲基化或半甲基化狀態(tài)的變化進(jìn)行調(diào)節(jié)。Zengetal.(2015)對(duì)水曲柳FraxinusmandschuricaRupr.、絨毛白蠟FraxinusvelutinaTorr及其雜交的F1代間的甲基化水平與模式進(jìn)行了分析。結(jié)果表明：雜交F1代幼苗具有較好的耐鹽性和生長優(yōu)勢，但其DNA甲基化模式變?yōu)橥獠堪奏ぜ谆?7.34%)。這提示了耐鹽性與DNA甲基化改變相關(guān)。Chenetal.(2015)檢測了擬南芥Arabidopsisthaliana(Arabidopsis)幼苗在不同Cu濃度處理下，甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在0.25與1.0 mg· L-1Cu處理下，幼苗的根生長率和鮮重沒有發(fā)生顯著變化，但其MSAP率先增高，然后再隨著Cu離子濃度的增高而降低。MSAP對(duì)低濃度Cu離子應(yīng)激較為敏感，可用作Cu污染的早期診斷和生態(tài)安全評(píng)估。另外，魯考弗美奇酵母處于外界不同環(huán)境時(shí)，其DNA甲基化模式也發(fā)生相應(yīng)變化(Herreraetal.,2012)?；厶欠值慕M成、濃度和它們之間的相互作用能顯著影響MSAP位點(diǎn)從非甲基化到甲基化轉(zhuǎn)變的概率；用甲基化抑制劑5-氮雜-2′-脫氧胞苷(5-AZA)處理后，魯考弗美奇酵母群落的生長被顯著抑制；DNA甲基化模式的變化與魯考弗美奇酵母從不同生境中獲取資源的能力密切相關(guān)，且呈正相關(guān)關(guān)系。

由此可見，MSAP能夠很好地檢測到逆境條件下生物體的DNA甲基化水平和模式變化，從而為研究其逆境相關(guān)基因的表觀調(diào)控奠定較好的基礎(chǔ)。

圖1　2004—2016年生態(tài)學(xué)領(lǐng)域發(fā)表的關(guān)于MSAP的論文數(shù)量

3.2MSAP與遺傳多樣性研究

MSAP是以AFLP技術(shù)為基礎(chǔ)發(fā)展而來的。AFLP作為一種常用的分子標(biāo)記方法，已大量應(yīng)用于種質(zhì)資源多樣性、遺傳圖譜構(gòu)建及基因定位等研究。因此，MSAP也可應(yīng)用于遺傳多樣性方面的研究。Massicotteetal.(2011)利用MSAP技術(shù)研究全雌性克隆魚Chrosomuseos-neogaeus的種群表觀遺傳變異。該研究分離出了15個(gè)MSAP候選位點(diǎn)，并對(duì)其進(jìn)行了亞硫酸氫鈉測序，以鑒定DNA甲基化差異的確切位點(diǎn)。其中4個(gè)候選位點(diǎn)不能被識(shí)別，至少有11個(gè)位點(diǎn)被推測與斑馬魚Brachydaniorerio基因組存在一定的相似性。此外，測序表明，在相鄰位置有額外的DNA甲基化變異，有些位點(diǎn)則總是被甲基化或總是非甲基化。Royetal.(2015)對(duì)3種玉米品種進(jìn)行了遺傳多樣性分析，揭示出品種分化不僅與遺傳變異有關(guān)，而且與表觀遺傳變異相關(guān) 。Guarinoetal.(2015)對(duì)撒丁島上的楊樹進(jìn)行了遺傳多樣性分析，發(fā)現(xiàn)楊樹的遺傳多樣性水平十分有限，然而其表觀遺傳變異水平較高，環(huán)境條件顯著影響了鏈內(nèi)胞嘧啶的半甲基化。不同地理分布的相同克隆分株，其甲基化不一樣。該研究表明，植物的多樣性不應(yīng)局限于遺傳方面，而應(yīng)考慮表觀遺傳差異性(特別是在無性繁殖情況下)。洪柳和鄧秀新(2005)對(duì)24個(gè)臍橙品種的胞嘧啶甲基化模式和程度進(jìn)行了評(píng)估。結(jié)果表明：臍橙基因組的CCGG序列中檢測到4.7%～15.0%的DNA發(fā)生甲基化；18對(duì)擴(kuò)增引物中有10對(duì)顯示具有多態(tài)性，總共得到639條帶，其中43條帶為甲基化多態(tài)性帶，平均甲基化多態(tài)性(P)比率達(dá)6.7%。DNA甲基化在臍橙中發(fā)生頻繁且品種之間的甲基化模式存在較大差異，臍橙CCGG序列中胞嘧啶甲基化外部(15.0%)多于內(nèi)部(4.7%)。

以上研究均在不同程度上證明了DNA甲基化是自然種群隨機(jī)變異的重要來源之一，而MSAP技術(shù)則是DNA甲基化多態(tài)性的重要定量方法。

3.3MSAP在入侵生物上的應(yīng)用

入侵植物日本虎杖Fallopiajaponica(Houtt.)是研究物種對(duì)新環(huán)境適應(yīng)的表觀遺傳的重要研究材料。日本虎杖能夠入侵到不同的生境，并且其大多數(shù)性狀在種群內(nèi)和種群間具有顯著差異，但其遺傳多樣性非常低。利用AFLP和MSAP分子標(biāo)記，Richardsetal.(2012b)研究了日本虎杖對(duì)新生境(沙灘、鹽沼、路邊)響應(yīng)的差異及與其表觀遺傳差異性之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示：在200個(gè)AFLP位點(diǎn)中，只檢測到4個(gè)位點(diǎn)具有多態(tài)性，同時(shí)檢測到8個(gè)單倍型，但樣本之間存在較大的表觀遺傳差異。180個(gè)MSAP位點(diǎn)中，19個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)產(chǎn)生了128個(gè)表觀基因型，并且有些表觀遺傳位點(diǎn)因生境條件而產(chǎn)生變異。水花生Atlernantheraphiloxeroides(Mart.) Griseb.是一種能夠水陸兩生的外來入侵植物，不同生境的水花生表現(xiàn)出不同的表型，然而其遺傳變異卻非常低。Gaoetal.(2010)通過MSAP分析不同來源地的水花生的遺傳變異和表觀遺傳變異，研究發(fā)現(xiàn)：78.2%的甲基化變化與不同水源相關(guān)，說明表觀遺傳調(diào)節(jié)系統(tǒng)具有敏感的環(huán)境性和靈活性，從而從分子水平上描述了水花生入侵不同生境的機(jī)理。因此，MSAP在解釋外來入侵生物在短時(shí)間內(nèi)入侵新生境的分子機(jī)制上具有重要作用。

4MSAP的局限性

MSAP技術(shù)有2個(gè)局限(Schreyetal.,2013)：(1)當(dāng)用MspⅠ和HpaⅡ酶不能切割(Salmonetal.,2008)時(shí)，試驗(yàn)所觀察到的條帶模式均可由遺傳原因(限制性位點(diǎn)的突變、鄰近限制性位點(diǎn)發(fā)生變化)和表觀遺傳原因(超甲基化、限制位點(diǎn)所有胞嘧啶甲基化)產(chǎn)生,致使一些甲基化狀態(tài)被遺漏；(2)AFLP型條帶模式的記分方法有待進(jìn)一步商榷，由于PCR的差異導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室之間很難達(dá)成統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，且每個(gè)樣本都必須進(jìn)行2個(gè)反應(yīng)之間的比較，因此在某些情況下，MspⅠ和HpaⅡ酶切反應(yīng)間的不同可能是由限制性酶切不一致或PCR反應(yīng)的差異造成，而并不是因?yàn)榧谆町愋运隆?/p>

另外，MSAP只能通過產(chǎn)生的不同片段長度來推斷基因組范圍內(nèi)的表觀遺傳變異，每個(gè)位點(diǎn)的相鄰序列未知。因此只能借助提取和片段序列測序，在數(shù)據(jù)庫中確定其同源序列(Massicotteetal.,2011；

Salmonetal.,2005)。此外，MSAP不能區(qū)分雜合體之間的表觀遺傳差異性。

5MSAP的未來發(fā)展

由于MSAP技術(shù)存在的局限性，在未來的研究中應(yīng)注意以下問題。第一，同時(shí)收集遺傳多樣性和DNA甲基化多態(tài)性數(shù)據(jù)。這些數(shù)據(jù)對(duì)于了解生物體對(duì)環(huán)境應(yīng)答反應(yīng)過程中所表觀的遺傳因素與基因遺傳因素之間的相互作用非常重要(Herrera & Bazaga,2011; Richardsetal.,2012b)。第二，同時(shí)使用MSAP以外的技術(shù)來確定甲基化靶標(biāo)，可顯著增加試驗(yàn)結(jié)果的可靠性。抽提MSAP條帶進(jìn)行測序和亞硫酸氫鹽測序(Massicotteetal.,2011)都將是解決MSAP技術(shù)局限性的第一步。隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，下一代測序技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用到表觀生態(tài)學(xué)上(Plattetal.,2015; Robertson & Richards,2015)。第三，如果必要，可使用如5-氮胞苷等藥物進(jìn)行試驗(yàn)性甲基化抑制，以更好地獲得DNA甲基化對(duì)表型影響的研究結(jié)果(Bossdorf,2010; Herreraetal.,2012)。第四，把同質(zhì)園試驗(yàn)加入到自然變異研究中(Richardsetal.,2012b)，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)統(tǒng)一處理樣本(Herreraetal.,2012)、調(diào)查外來入侵物種(Richardsetal.,2012b)、明晰環(huán)境刺激因子(Herrera & Bazaga,2011)和區(qū)分生境條件(Herreraetal.,2012; Richardsetal.,2012b)等。

此外，許多研究表明：表觀遺傳學(xué)機(jī)制是種群入侵新生境在生境范圍內(nèi)擴(kuò)增的重要機(jī)理(Chwedorzewska & Bednarek,2012; Richardsetal.,2012b; Schreyetal.,2012)。DNA甲基化將在生物種群響應(yīng)和快速適應(yīng)全球氣候變化引發(fā)的環(huán)境變化過程中發(fā)揮越來越重要的作用。其對(duì)環(huán)境響應(yīng)、全球變化及人類健康等一系列生物學(xué)問題均有較好的啟示作用。通過分析多個(gè)種群在一系列環(huán)境下的差異，MSAP技術(shù)能夠辨別出對(duì)環(huán)境變化具有最大調(diào)節(jié)能力的特異種群(或物種)。這將告訴我們哪個(gè)種群因缺少必要的多樣性而處于下降危險(xiǎn)中。而這些問題最終都?xì)w結(jié)為基因型如何轉(zhuǎn)換為表型的解密。MSAP技術(shù)能夠用于目標(biāo)特異性技術(shù)之間的聯(lián)合，從而解析DNA甲基化在個(gè)體應(yīng)對(duì)環(huán)境變化中的作用。

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(責(zé)任編輯:郭瑩)

Progress on methylation-sensitive amplified polymorphism and its application in ecology

Zhi GONG1,2, Ya-nan ZHANG3, Shi-hao ZHOU3, Yue-guan FU1,2*

1EnvironmentandPlantProtectionInstitute,ChineseAcademyofTropicalAgriculturalSciences,Haikou,Hainan571101,China；2KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonTropicalCrops,MinistryofAgriculture,Haikou,Hainan571101，China；3CollegeofEnvironmentandPlantProtection,HainanUniversity,Haikou,Hainan570228,China

Abstract:DNA methylation is one of the most important modifications in epigenetics, and becomes increasingly popular in ecology. Based on published papers about ecological epigenetics, principle, advantages and limitations, applications and prospects in ecology are discussed. Methylation-sensitive amplified polymorphism (MSAP) has been an effective method for DNA methylation because of its wide range of applications and simple operation, especially on subject of ecology problems, such as rapid adaptation to changing habitats and overcoming genetic bottleneck for alien invasive species. MSAP can reveal epigenetic variation within or between populations well, and acts as apowerful supplement to the study of genetic diversity and variation.

Key words:methylation-sensitive amplified polymorphism; ecology; population variation; ecological epigenetics

DOI:10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.01.002

作者簡介:龔治， 男， 博士研究生。 研究方向: 外來入侵生物與昆蟲分子生物學(xué)。 E-mail: zhigong11@163.com*通訊作者(Author for correspondence), E-mail: fygcatas@163.com

基金項(xiàng)目:公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項(xiàng)(201103026-1、201403075)

收稿日期(Received)： 2015-10-16接受日期(Accepted)： 2015-11-28