閆小梅，虞 麗，李 根，鄭文波，武 俊，胡 鋒，李輝信

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

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兩種土著食細菌線蟲對五種細菌的取食偏好及相關(guān)機制①

閆小梅，虞 麗，李 根，鄭文波，武 俊，胡 鋒，李輝信*

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，南京 210095)

摘 要：食細菌線蟲通過取食細菌改變土壤微生物的活性和群落結(jié)構(gòu)從而影響土壤生態(tài)系統(tǒng)功能，而食細菌線蟲取食細菌存在選擇偏好。本試驗通過設(shè)置“自助餐”式平板培養(yǎng)試驗，研究了2種土著食細菌線蟲(擬麗突屬線蟲和中桿屬線蟲)對5種細菌的活菌體、滅活菌體及菌體分泌物的取食偏好，以為進一步揭示土壤生態(tài)系統(tǒng)中食細菌線蟲與細菌相互作用關(guān)系奠定基礎(chǔ)。研究結(jié)果顯示：擬麗突屬和中桿屬線蟲對活菌體的取食偏好基本一致，均對G-菌具有偏好，其偏好順序為：熒光假單胞菌＞大腸桿菌＞貪噬菌＞解淀粉芽孢桿菌＞巨大芽孢桿菌。擬麗突屬線蟲對5種細菌分泌物的辨識和取食不存在選擇性偏好，從而使其對活菌體及滅活菌體的取食偏好順序基本一致；而中桿屬線蟲對活菌體及滅活菌體的取食偏好存在顯著差異，這可能與中桿屬線蟲對5種細菌分泌物的辨識和取食具有選擇性偏好有關(guān)。細菌分泌物對中桿屬線蟲的取食偏好機制還有待進一步研究。

關(guān)鍵詞：食細菌線蟲；細菌；取食偏好；分泌物

土壤線蟲是土壤動物的主要功能類群之一，是土壤中最為豐富的后生動物[1]。土壤食細菌線蟲在土壤根際的比例更高可達90% 左右[2]，其通過取食不同細菌而改變微生物數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)，從而對土壤的碳、氮、磷等(尤其是氮素)轉(zhuǎn)化和循環(huán)產(chǎn)生重要影響[3-5]。

生物在取食時往往存在對食物資源的選擇性或偏好性，這一現(xiàn)象也適用于低等的原生動物和線蟲等[6-7]。例如，研究表明模式線蟲Caenorhabditis elegans(秀麗隱桿線蟲)會偏愛取食那些易于取食并能很好提供線蟲生長的細菌，而遠離難于取食的細菌[8]。Niu等[9]研究發(fā)現(xiàn)細菌產(chǎn)生的揮發(fā)性代謝產(chǎn)物能夠吸引線蟲，從而影響線蟲的取食偏好。食細菌線蟲選擇性取食土壤細菌不但會改變土壤微生物數(shù)量、活性和群落結(jié)構(gòu)，還會直接影響線蟲的生存適應(yīng)性及健康[10-11]。Venette 和 Ferris[12]發(fā)現(xiàn)細菌的類型和密度會影響食細菌線蟲繁殖率和生長；模式線蟲C.elegans的選擇性取食還會顯著影響其新陳代謝、線粒體DNA復(fù)制水平、以及其壽命和產(chǎn)卵數(shù)等[13]。因此，土壤食細菌線蟲的選擇性取食(即偏好性)近年來備受研究者的關(guān)注[14-15]。盡管研究人員發(fā)現(xiàn)許多的食細菌線蟲具有取食偏好性，但這些報道大都是研究線蟲對活菌體的取食偏好，而對取食偏好機制，特別是細菌分泌物在取食偏好中的作用等方面的研究尚十分薄弱。

為模擬一個食細菌線蟲取食的真實生態(tài)環(huán)境，本實驗從土壤中分離出2株土著食細菌線蟲(擬麗突屬和中桿屬線蟲)作為實驗材料，同時從該土中篩選出4株優(yōu)勢細菌并以大腸桿菌OP50為對照，研究土著食細菌線蟲對不同種類細菌的活菌體、滅活菌體及菌體分泌物(代謝產(chǎn)物)的取食偏好性，以探索菌體分泌物在食細菌線蟲取食偏好中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌株：E.coli OP50以及實驗室從土壤中分離得到的4株可培養(yǎng)的細菌為：解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、貪噬菌(Variovorax sp.)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)、熒光假單胞菌(P.fluorescens)(表1)。

表1　供試細菌基本性質(zhì)Table 1 Basic characteristics of the bacteria tested

供試線蟲：擬麗突屬線蟲(Acrobeloides sp.)：cp值為2，產(chǎn)卵量大，世代時間短，較耐環(huán)境壓力。中桿屬線蟲(Mesorhabditis sp.)：cp值為1，產(chǎn)卵量巨大，世代時間極短，在食物豐富的條件下種群爆發(fā)，極耐環(huán)境壓力，典型的機會主義者。供試線蟲圖片見圖1。

圖1　線蟲圖片(左圖為擬麗突屬線蟲，右圖為中桿屬線蟲)Fig.1 Images of nematodes(left is Acrobeloides sp.,right is Mesorhabditis sp.)

培養(yǎng)基：線蟲培養(yǎng)基(NGM)：NaCl 3 g，蛋白胨2.5 g，瓊脂 15 g，水 975 ml，121℃滅菌20 min之后，加入膽固醇1 ml，CaCl21 ml，MgSO41 ml，磷酸緩沖液25 ml。細菌液體培養(yǎng)基(LB)：NaCl 10 g，胰蛋白胨 10 g，酵母粉 5 g，水 1 000 ml，121℃滅菌20 min。在培養(yǎng)液中加入15 g瓊脂粉，即為固體LB培養(yǎng)基。

線蟲的培養(yǎng)與制備：將食細菌線蟲接種至長有E.coli的線蟲培養(yǎng)基(NGM)上并置于20℃的恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。線蟲培養(yǎng)20天后用貝爾曼漏斗法分離，收集到的線蟲用無菌水反復(fù)沖洗后備用。

1.2 實驗方法

按照“自助餐”式進行取食偏好實驗設(shè)計[16]，如圖2所示，即將直徑8.5 cm，高約1.2 cm的培養(yǎng)皿分成5個區(qū)域，每個區(qū)域中心分別接種上述5種活菌體(滅活菌體或者菌體分泌物)，培養(yǎng)基的中心位置接種約1 000條食細菌線蟲，共設(shè)置8個重復(fù)。在接種線蟲后的第2、4、8、12、24 h置于體視鏡下觀察計算線蟲在5種活菌體(滅活菌體或菌體分泌物)中的數(shù)量。

活菌體的制備和接種量：取5株細菌培養(yǎng)液，10 000 r/min離心，棄上清液，用無菌水沖洗3次后重懸，在5個區(qū)域中心分別接種20 μl活菌體(活菌體中含細菌分泌物)。

滅活菌體的制備和接種量：取5株細菌培養(yǎng)液，10 000 r/min離心，棄上清液，用無菌水沖洗3次后重懸，用γ射線滅活后，在5個區(qū)域中心分別接種20 μl滅活菌體(滅活菌體不含細菌分泌物)。

菌體分泌物的制備和接種量：取5株細菌培養(yǎng)液，10 000 r/min離心，收集上清懸浮液，經(jīng)過除菌濾膜處理后，在5個區(qū)域中心分別接種20 μl菌體分泌物。

圖2　食細菌線蟲對不同種類細菌取食偏好實驗設(shè)計Fig.2 Experimental design of feeding preferences of bacterial-nematodes for different bacteria

1.3 數(shù)據(jù)處理

用SPSS17.0進行單因素方差分析，用Duncan法進行顯著性檢驗(P＜0.05)，采用SigmaPlot軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 食細菌線蟲對活菌的取食偏好性

從圖3可以看出，接種擬麗突屬線蟲4 h后，5種細菌上的線蟲數(shù)量較少且沒有差異，而8 h后菌體上線蟲數(shù)量明顯增多，P.f 和E.c上線蟲的數(shù)量顯著高于其他幾種細菌。在之后的整個培養(yǎng)期內(nèi)線蟲在細菌上的數(shù)量隨著時間而不斷增加，而且P.f上的線蟲數(shù)量顯著高于B.a、V.s、B.m和E.c上的線蟲數(shù)。在24 h時E.c和V.s上的線蟲數(shù)沒有顯著差異，而B.a 和B.m上的線蟲數(shù)在4～24 h內(nèi)均無顯著差異?？梢?，擬麗突屬線蟲偏好選擇P.f，其次是E.c和V.s，對B.a 和B.m偏好性較弱。中桿屬線蟲對5種活菌體的偏好和擬麗突屬是一致的，但是中桿屬線蟲在4 h時對細菌已表現(xiàn)出偏好，而擬麗突屬在8 h才表現(xiàn)出偏好。

2.2 食細菌線蟲對滅活菌的取食偏好性

從圖4可以看出，在接種擬麗突屬線蟲4 h后，在5種滅活菌上的線蟲數(shù)量沒有差異，直到8 h才出現(xiàn)差異，在24 h時，滅活菌E.c上的線蟲數(shù)量顯著高于其他4種滅活細菌上的線蟲數(shù)量，滅活的B.a和B.m上的線蟲數(shù)量在4～24 h內(nèi)無顯著差異。擬麗突屬線蟲偏好選擇滅活的E.c，其次是P.f和V.s，而對滅活的B.a和B.m這兩株菌的取食偏好最低。與取食活菌相比，擬麗突屬線蟲對滅活菌和活菌的取食偏好順序基本一致。在接種中桿屬線蟲的整個培養(yǎng)期內(nèi)，滅活的E.c上的線蟲數(shù)量顯著高于其他幾種滅活的菌體上的線蟲數(shù)量。中桿屬線蟲偏好選擇滅活的E.c，其次是B.a，而對滅活的V.s、B.m和P.f的取食偏好很低。與取食活菌相比，中桿屬線蟲對滅活的P.f偏好性顯著減弱，而對滅活的B.a偏好性顯著增加。

圖3　兩種線蟲對不同種類細菌活菌體的取食偏好Fig.3 Feeding preferences of two nematodes for different live bacteria

圖4　兩種線蟲對不同種類細菌的滅活菌體的取食偏好Fig.4 Feeding preferences of two nematodes for different killed bacteria

2.3 食細菌線蟲對細菌分泌物的取食偏好性

接種擬麗突屬線蟲2 h后，在V.s分泌物上的線蟲數(shù)量均顯著低于其他4種細菌分泌物，而4 h之后的整個培養(yǎng)期內(nèi)5種菌體分泌物上的線蟲數(shù)量都沒有顯著差異。在12 h時，5種菌體分泌物上的線蟲數(shù)量均有降低的趨勢(圖5)。中桿屬線蟲對菌體分泌物的取食偏好與對活菌體的偏好是一致的(圖3，圖5)，偏好選擇P.f的分泌物，其次是E.c，而對B.a和B.m這兩株菌體分泌物的偏好選擇很低。

圖5　兩種線蟲對不同種類細菌的分泌物的取食偏好Fig.5 Feeding preferences of two nematodes for different bacterial secretions

3 討論

食細菌線蟲對活菌體的取食存在偏好性，P.f細菌更吸引擬麗突屬線蟲和中桿屬線蟲，其次是E.c和V.s，這3株細菌(P.f、E.c、V.s)均為G-細菌，而偏好較差的均為G+細菌。肖海峰等[17]和Salinas等[18]的研究也發(fā)現(xiàn)食細菌線蟲是對土壤中G- 細菌有更大的偏好。G+細菌的細胞壁比較厚，肽聚糖含量豐富；G-細菌的細胞壁較G+細菌薄，肽聚糖含量低，交聯(lián)松散，這一差異使得G-細菌被食細菌線蟲所取食后更容易被消化。Ronn等[19]研究證明G+細菌會因難以被消化而被原生動物排泄出來。盡管本實驗的結(jié)果與大多研究者的研究結(jié)果一致，即食細菌線蟲偏好取食G-細菌，但也有少數(shù)研究者發(fā)現(xiàn)了相反的結(jié)果。如Moens等[20]發(fā)現(xiàn)一種海洋中的食細菌線蟲(Diplolaimella dievengatensis)偏好取食G+細菌(Halobacillus trueperi)，這可能和線蟲的種類不同有關(guān)。

食細菌線蟲對不同滅活菌體的取食同樣存在差異，擬麗突屬線蟲對滅活菌體的偏好與其對活菌的取食偏好順序基本一致。中桿屬線蟲對滅活的菌體的偏好與其對活菌體的取食偏好順序產(chǎn)生明顯差異，產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是滅活的P.f不適合中桿屬線蟲的生長。Moens等[20]在研究海洋食細菌線蟲D.meyli的取食時發(fā)現(xiàn)，相對于活菌體，該線蟲偏好取食滅活的菌體。

細菌分泌物上的線蟲數(shù)量遠遠低于活菌體及滅活菌體上的線蟲數(shù)量，并且在12 h后會有所減少，這與分泌物主要起到吸引線蟲而缺少足夠的食物供應(yīng)有關(guān)。細菌的分泌物對擬麗突屬線蟲的取食偏好沒有影響，擬麗突屬線蟲對不同細菌的取食偏好可能主要取決于細菌的其他性狀(如大小、形狀、G+或G-)。然而，中桿屬線蟲對細菌分泌物的取食存在明顯的偏好；而且中桿屬線蟲對活菌(含分泌物)和滅活菌(不含分泌物)的取食偏好差異很大。中桿屬線蟲對滅活的B.a菌有很強的偏好，但是對其活菌和分泌物并沒有偏好，這可能是B.a的分泌物對中桿屬有抑制作用。事實上，有些細菌的代謝產(chǎn)物對線蟲是有毒性的[21-22]，至于細菌分泌物的組成和毒性還需進一步的深入研究。

食細菌線蟲通過化學(xué)信號和趨化機制移至或遠離細菌[23]。在本研究中，兩種食細菌線蟲并沒有表現(xiàn)出對細菌的瞬時趨化反應(yīng)，但8 h內(nèi)在不同細菌之間的取食選擇表現(xiàn)了線蟲對細菌具有取食偏好性。取食偏好不僅僅是由趨化性引起的，它是由線蟲對食物辨識、尋找、食物的適口性等因素共同影響[24]，不同食細菌線蟲對細菌取食偏好的機制還需要進行更深入的研究。

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Feeding Preference of Bacterial-feeding Nematodes to Five Different Bacteria and Its Mechanisms

YAN Xiaomei,YU Li,LI Gen,ZHENG Wenbo,WU Jun,HU Feng,LI Huixin*
(College of Resources and Environmental Sciences,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China)

Abstract:Bacterial-feeding nematodes can influence the function of soil ecosystems by altering bacterial activity and community structure.There is a feeding preference when bacterial-feeding nematodes confront towards different bacteria.A “cafeteria” diet experiment was set up to study the feeding behavior of Acrobeloides sp.and Mesorhabditis sp.to the living bacteria,killed bacteria and bacterial secretions of five bacteria in order to help us understand better the interactions between bacterial-feeding nematodes and bacterial community structure in soil ecosystems.The results demonstrated that the feeding preferences of Acrobeloides sp.and Mesorhabditis sp.to five living bacteria were similar.The two nematodes both preferred G-bacteria and the feeding preference order was P.fluorescens＞E.coli＞ Variovorax sp.＞ B.amyloliquefaciens ＞ B.megaterium.Acrobeloides sp.did not show preference to the five bacterial secretions which led to the feeding preference of Acrobeloides sp.to living bacteria and killed bacteria were similar.In contrast,there were big differences in feeding preference of Mesorhabditis sp.to living bacteria and killed bacteria,this may be related to the feeding preference of Mesorhabditis sp.to different bacterial secretions.However,the mechanism of bacterial secretions on feeding preference of Mesorhabditis sp.needs further study.

Key words:Bacterial-feeding nematodes; Bacteria; Feeding preference; Secretion

作者簡介：閆小梅(1993—)，女，安徽淮北人，碩士研究生，主要從事恢復(fù)生態(tài)學(xué)的研究。E-mail:2012103026@njau.edu.cn

* 通訊作者(huixinli@njau.edu.cn)

基金項目：①國家自然科學(xué)基金項目(41271270)資助。

DOI:10.13758/j.cnki.tr.2016.01.013

中圖分類號：S154.5