杭　航， 伍國鋒*， 王麗琨， 周海燕

(貴州醫(yī)科大學 急診醫(yī)學教研室， 貴州 貴陽　550004)

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乳鼠腦小膠質細胞原代培養(yǎng)與鑒定*

杭航**， 伍國鋒***， 王麗琨， 周海燕

(貴州醫(yī)科大學 急診醫(yī)學教研室， 貴州 貴陽550004)

[摘要]目的： 探索乳鼠小膠質細胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法。方法： 取新生SD乳鼠腦組織搗碎、消化及共培養(yǎng)，用振搖法分離純化小膠質細胞并繼續(xù)培養(yǎng)；在相差顯微鏡下觀察共培養(yǎng)第3、9及14天時細胞形態(tài)，計數純化培養(yǎng)后小膠質細胞數及存活率，采用免疫細胞化學染色方法在共聚焦顯微鏡下計數純化培養(yǎng)后小膠質細胞特異性OX-42抗體表達陽性的細胞數及存活率，同時觀察小膠質細胞活化形態(tài)；觀察純化培養(yǎng)12、24、48及72 h后小膠質細胞的靜止型細胞數和靜止率。結果: 振搖法共培養(yǎng)第14天時可見胞體折光不均的星形膠質細胞最多，分離時可獲得1.2×10(6 )個/瓶(75 cm2,250 mL)小膠質細胞，免疫細胞化學染色顯示小膠質細胞特異性OX-42表達陽性細胞達95%，存活率>95%；在顯微鏡下小膠質細胞形態(tài)以阿米巴樣、長梭形及馬鞍形為主；純化培養(yǎng)72 h后小膠質細胞的靜止型細胞數和靜止率最高。結論： 振搖法分離小膠質細胞純化培養(yǎng)72 h,可獲得最高的靜止型小膠質細胞數和靜止率。

[關鍵詞]大鼠,Sprague-Dawley； 小膠質細胞； 培養(yǎng)； 振搖法； 純化； 鑒定

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)主要的3種膠質細胞之一，其數量約占總膠質細胞總數的10%，是中樞神經系統(tǒng)的免疫細胞，具有與外周巨噬細胞最相似的結構和功能[1-2]。小膠質細胞可通過釋放促炎或抗炎介質對機體感染或損傷作出快速反應，影響疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。因此建立一種在體外培養(yǎng)并能進行鑒定的腦小膠質細胞培養(yǎng)的方法尤為重要[4]，本研究用振搖法分離純化小膠質細胞并鑒定，探索乳鼠小膠質細胞的原代培養(yǎng)和鑒定方法，報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物、儀器與試劑

新生1～2 d的SD乳鼠(由貴州醫(yī)科大學動物實驗中心提供)，體質量5～8 g。北美胎牛血清(FBS) ，DMEM/F12培養(yǎng)基，胰酶(含EDTA，0.25%)，Hanks液，PBS液，青霉素-鏈霉素溶液，GlutaMax；多聚L-賴氨酸，脫氧核糖核酸酶Ⅰ(DnaseⅠ)，小鼠單克隆抗體CD11b/c(OX-42)。4%多聚甲醛溶液，山羊抗兔二抗異硫氰酸熒光素(FITC)，封閉山羊血清，抗熒光衰減封片劑及細胞核染料(DAPI)。

1.2方法

1.2.1混合膠質細胞共培養(yǎng)將1～2 d的新生SD乳鼠用CO2吸入法處死后，無菌條件下取出腦組織，放入Hanks液中浸泡，僅保留雙側大腦半球，仔細將腦膜和血管剝離，再放入DMEM/F12 培養(yǎng)基中剪碎，轉移至15 mL離心管中，加入等量0.25%的胰酶消化液，37 ℃消化4 min，按1∶1比例加入含10%胎牛血清、1%雙抗、1% DMEM /F12高糖完全培養(yǎng)基終止消化，加入適量的DnaseⅠ(30 000 U/L)，37 ℃消化2 min， 200目過濾，收集濾液，1 500 r/min 離心5 min，棄上清液，用完全培養(yǎng)基進行細胞沉淀懸浮后進行細胞計數，以2×106個接種至用0.001%多聚L-賴氨酸包被的75 cm2培養(yǎng)瓶培養(yǎng)，24 h后全量換液；之后觀察細胞生長，約3 d進行一次半量換液，培養(yǎng)至第7～9天時可見膠質細胞分層，下層細胞連成片主要是神經元、星形膠質細胞，細胞鋪展均勻，上層細胞為圓形或橢圓形，透光性好，主要是小膠質細胞、少突膠質細胞，收集上層細胞。

1.2.2分離及純化小膠質細胞待原代細胞培養(yǎng)第7～9天，細胞充分分層生長后，再繼續(xù)培養(yǎng)至第14天時，吸除約10 mL培養(yǎng)液，將培養(yǎng)瓶口封口后放在37 ℃恒溫搖床上200 r/min振蕩2 h，收集培養(yǎng)液直接接種至涂布0.001%多聚L-賴氨酸的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)箱放置約1 h，鏡下可見大部分細胞貼壁，此時半量換液1次，加入含10 %胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。分離后的混合細胞繼續(xù)培養(yǎng)3 d ，第2次收取小膠質細胞。

1.2.3免疫細胞化學染色取分離培養(yǎng)24 h的細胞爬片經PBS液充分洗滌后，用4%的多聚甲醛固定15 min，用0.25% Triton處理20 min，10%正常山羊血清封閉，PBS洗3次(3 min/次)；分別加入一抗小膠質細胞特異性標志物0X-42抗體[5]，濃度為1∶50、1∶100及1∶250，37 ℃孵育2 h，PBS洗3次(3 min/次)；加入二抗山羊抗小鼠FITC ，37 ℃避光孵育1 h，PBS洗3次(3 min/次)；DAPI染核5 min，最后加入抗熒光淬滅封片劑封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察、攝片。用PBS及正常牛血清代替一抗作為對照染色。FITC是一種綠色熒光染料，若0X-42表達會呈綠色；DAPI則是一種藍色染核染料，專染細胞核，如為藍色說明所染細胞是活細胞或是有核細胞；活細胞陽性率則用Merge進行判斷，為FITC和DAPI二者染色的融合圖片。

1.3統(tǒng)計學分析

2結果

2.1混合共培養(yǎng)時神經膠質細胞形態(tài)

第3天　　　　　　　　　　　第9天　　　　　　　　 第14天圖1　混合共培養(yǎng)的小膠質細胞(200×)Fig.1　The growth of cultured microglia cells in different time points under the phase contrast microscope

混合共培養(yǎng)第3天時，相差顯微鏡下觀察可見細胞逐漸生長，比較稀疏；培養(yǎng)至第9天時間細胞開始分層，底部的細胞為星形膠質細胞及少突細胞，而上面圓形透光性好的為小膠質細胞；第14天時，上層小膠質細胞數量增多，細胞分層明顯，底層細胞充分鋪展，緊密接觸，其上層主要為散在分布的阿米巴樣細胞，胞體圓形，透光性較底層細胞好，相差顯微鏡下可見胞體折光不均，為星形膠質細胞(圖1)。 2.2純化小膠質細胞存活率

第1天　　　　　　　　　　 第2天　　　　　　　　　　第3天圖2　純化培養(yǎng)的小膠質細胞(200×)Fig.2　Microglia cells in culture and purification

圖3　免疫組織化學染色鑒定小膠質細胞(200×)Fig.3　The expression of OX42 detected by immunohistochemistry for identification of microglias

將培養(yǎng)瓶置于37 ℃恒溫搖床上以200 r/min振搖 2 h后，可見位于上層的小膠質細胞開始懸浮，計數小膠質細胞產量為1.5 ×106個，存活率>95%。經純化分離后的小膠質細胞多在1 h左右貼壁，多為圓形，邊緣不規(guī)則；培養(yǎng)至第2天時部分細胞胞體回縮，少量細胞伸出突起，多為單極，也有呈雙極，部分細胞伸展為梭形、馬鞍形及不規(guī)則形，但部分細胞仍為圓形；培養(yǎng)至第3天時，見約半數細胞由活化態(tài)轉為靜止狀態(tài)，即胞體狹長， 可見不對稱分支，形態(tài)伸展為梭形、馬鞍形或不規(guī)則形(圖2)。0X-42染色顯示細胞形態(tài)呈長梭形、不規(guī)則形等形狀，細胞質染色均勻，呈草綠色；DAPI染色顯示細胞核被染成藍色，Merge后重疊率達95%以上，證明分離純化的細胞為小膠質細胞；一抗對照組DAPI染色雖可見細胞核也被染成藍色，但FITC無細胞著色，Merge重疊后未見細胞著色(圖3)。

2.3小膠質細胞增殖

純化培養(yǎng)各時間點的細胞總數比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而各時間點靜止細胞數和靜止率比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)， 24、48及72 h靜止細胞數和靜止率高于12 h(P<0.01)，72 h最高，見表1。

表1　純化培養(yǎng)不同時間點小膠質細胞

(1)與12 h組比較，P<0.01；(2)與24 h組比較，P<0.01；(3)與48 h組比較，P<0.01

3討論

小膠質細胞屬于單核吞噬細胞系統(tǒng)，生理情況下，靜息的小膠質細胞可以通過遷移及吞飲的功能從而清除自身壞死組織及廢物，而活化的小膠質細胞則可以通過分泌多種細胞因子從而促進細胞生長及自我修復[6]；病理狀態(tài)下，特別是中樞神經系統(tǒng)受損時，小膠質細胞在各種病原物質的刺激下持續(xù)激活，不僅分泌多種炎性因子，還會產生大量一氧化氮、超氧陰離子、谷氨酸和其他神經毒素，從而造成大腦的進一步損傷[7]。越來越多的證據表明，腦出血后血腫中的血紅細胞裂解后，可釋放大量的凝血酶等細胞毒性物質，這些細胞毒性物質可直接產生氧自由基或通過激活小膠質細胞和(或)巨噬細胞產生氧自由基，而氧自由基可誘發(fā)氧化應激反應，造成繼發(fā)性腦損傷[8-9]。因而，建立一種穩(wěn)定而優(yōu)化的培養(yǎng)及分離小膠質細胞的方法，有助于小膠質細胞和(或)巨噬細胞的吞噬功能及降低氧化應激反應的相關研究，對腦缺血、創(chuàng)傷等疾病的防治提供了重要的實驗基礎。

常規(guī)的小膠質細胞純化培養(yǎng)主要來源于McCarthy 建立的星形膠質細胞及少突膠質細胞純化培養(yǎng)的方法，之后國內外也有人改良為手動振搖法及消化法[10-12]。在前人的操作步驟中，筆者所在課題組在前期混合膠質細胞培養(yǎng)時選擇高密度膠質細胞種植于細胞培養(yǎng)瓶中，細胞約在第7～9天可出現(xiàn)分層現(xiàn)象，并且將振搖條件設定為200 r/min，2 h振搖細胞，振搖后不進行離心分離細胞，直接將懸液種植于培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)板中，待1 h貼壁完全后進行換液，這樣的操作可以收獲質量好，數量多的小膠質細胞。本次研究則發(fā)現(xiàn)，在提取細胞的操作中，應盡量避免離心的過程，這樣能最大限度的減少細胞損傷，使得細胞很快從激活狀態(tài)轉換至靜息狀態(tài)，得到優(yōu)質的小膠質細胞；本研究中選擇小膠質細胞的特異性抗體0X-42[5]鑒定純化后培養(yǎng)的小膠質細胞陽性細胞率達95 %以上。小膠質細胞分為靜止型和激活型，本實驗的另一目的為在體外建立一個穩(wěn)定的靜止型細胞模型，未后續(xù)研究提供正常生理條件下的細胞模型。結果發(fā)現(xiàn)分離后的小膠質細胞在24、48及72 h的靜止細胞率顯著高于分離后12 h組，且以分離后72 h的靜止細胞數最多。為體外研究靜息狀態(tài)的小膠質細胞提供可靠的細胞實驗模型。

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(2015-12-08收稿，2016-02-21修回)

中文編輯： 吳昌學； 英文編輯： 劉華

Primary Culture and Identification of Microglias from Neonatal Rat Brain

HANG Hang, WU Guofeng, WANG Likun, ZHOU Haiyan

(DepartmentofEmergencyMedicine,GuizhouMedicalUniversity,Guiyang550004,Guizhou,China)

[Abstract]Objective: To explore the method of primary culture and identification of microglia cells from the neonatal rats. Methods: The brain tissues from the neonatal SD rats were stamped, digested and co-cultured. The microglia cells were isolated and purified by shaking method and continued to be cultured. The cellular morphology was observed under phase contrast microscope at day three, day nine and day fourteen after co-culture, and the number of microglia cells was counted and survive rate was detected after purification and culture. Immunocytochemical staining method was adopted to count cell number of positive expression of specific OX-42 antibody of microglia cells and survive rate after purification and culture under confocal microscopy. The morphology was observed by the inverted phase contrast microscope, and the resting cell number and resting rate 12, 24, 48 and 72 hours after purification and culture were counted. Results: It was observed that there were abundant astrocytes of uneven refraction 14 days after shaking method and co-culture. Immunocytochemical stain showed that the method steadily produced 1.2×106 cells per flask (75 cm2,250 mL) with high survival rate (>95%) and the high positive rate (>95%)of expression of OX-42. Under the microscope, the morphology of microglia cells was mainly ameboid morphous, long spindle shape and saddle. The number of resting cells and the rate of resting cells were the highest 72 hours after purification and culture. Conclusion: The microglia cells were isolated and purified by shaking method and continued to be cultured for 72 hours and the highest resting cells number and resting rate can be obtained.

[Key words]rats,Sprague-Dawley; microglia cells; culture; shaking method; purification; identify

[中圖分類號]R459.7

[文獻標識碼]A

[文章編號]1000-2707(2016)03-0272-04

*[基金項目]國家自然科學基金資助項目(No. 81460185/H09106)； 貴州省科技基金(2013-2043)

**貴州醫(yī)科大學2013級碩士研究生

***通信作者 E-mail:wuguofeng3013@sina.com

網絡出版時間：2016-03-17網絡出版地址：http://www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160317.1102.054.html