李光榮，向成玉，楊　葵，劉靳波

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000)

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·論著·

醫(yī)院分離耐碳青霉烯類藥物鮑曼不動桿菌親緣性的研究*1

李光榮，向成玉，楊葵，劉靳波△

(瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，四川瀘州 646000)

摘要:目的通過分析鮑曼不動桿菌(Ab)碳青霉烯類藥物耐藥和敏感菌株蛋白指紋圖譜，了解碳青霉烯類藥物耐藥菌株親緣性遠(yuǎn)近的臨床應(yīng)用價值。方法收集臨床分離對碳青霉烯類藥物耐藥(22株)和敏感的Ab(18株)，利用表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)檢測細(xì)菌蛋白質(zhì)指紋圖譜。采用Biomarker Wizard 3.1 軟件分析碳青霉烯類藥物耐藥和敏感Ab相關(guān)差異蛋白，采用SPSS 19.0對差異蛋白進(jìn)行聚類分析，追溯其臨床感染的親緣性。結(jié)果碳青霉烯類藥物耐藥與敏感的Ab菌株間蛋白質(zhì)譜的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。聚類分析結(jié)果顯示碳青霉烯類藥物耐藥Ab在院內(nèi)的分布以A型為主，B型次之。結(jié)論聚類分析碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的Ab蛋白質(zhì)譜結(jié)果能夠判斷細(xì)菌親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，可為Ab感染和臨床流行病學(xué)調(diào)查提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞:鮑曼不動桿菌；表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)；聚類分析；蛋白組學(xué)

鮑曼不動桿菌(Ab)大量存在于醫(yī)療環(huán)境中，常?？蓪?dǎo)致嚴(yán)重的院內(nèi)感染，根據(jù)2013年CHINET數(shù)據(jù)顯示，Ab的臨床分離率已高于銅綠假單胞菌，位居非發(fā)酵菌臨床分離率第一位[1]。碳青霉烯類藥物是β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物。近年來關(guān)于Ab耐碳青霉烯類抗菌藥物的報(bào)道越來越多，患者一旦感染對碳青霉烯類藥物耐藥的Ab，常規(guī)抗菌藥物基本治療無效，患者往往死于無藥可選[2]，因而如何治療對碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的Ab感染已經(jīng)成為一個棘手的問題。隨著表面增強(qiáng)激光解析電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)(SELDI-TOF-MS)的廣泛應(yīng)用，蛋白組學(xué)在細(xì)菌耐藥機(jī)制方面的應(yīng)用也越來越多。本研究采用SELDI-TOF-MS技術(shù)檢測對碳青霉烯類藥物耐藥的Ab株蛋白質(zhì)表達(dá)譜，尋找碳青霉烯類藥物耐藥和敏感菌株之間的微量差異蛋白，通過對耐藥菌株蛋白質(zhì)指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，探討蛋白質(zhì)組學(xué)在Ab親緣性方面的價值，為院內(nèi)Ab的感染和流行病學(xué)調(diào)查提供合理的依據(jù)。

1材料與方法

1.1菌株來源收集2011年1月至2013年4月本院臨床分離的Ab 40株，剔除同一患者同一部位分離的菌株，其中碳青霉烯類藥物耐藥和敏感菌株分別為22株和18株。

1.2儀器與試劑MicroScan WalkAway 96全自動微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)及其配套試劑(德國西門子公司)，蛋白芯片時間質(zhì)譜儀(PBS Ⅱ C)(Ciphergen Biosystems Inc),Au芯片(美國Bio-Rad公司)，低溫臺式高速離心機(jī)(5415D) (德國Eppendof公司)，芥子酸(美國Bio-Rad公司)，三氟乙酸、甲酸、胰島素(美國Sigma公司)，亞胺培南和美羅培南藥敏紙片(Oxoid公司)。

1.3方法

1.3.1細(xì)菌鑒定和藥敏試驗(yàn)全部Ab均通過菌落形態(tài)，革蘭染色后鏡下形狀及MicroScan WalkAway96全自動微生物鑒定/藥敏測試系統(tǒng)獲得。用亞胺培南、美羅培南藥敏紙片對經(jīng)儀器鑒定為亞胺培南耐藥的Ab采用紙片擴(kuò)散法(K-B法)進(jìn)行驗(yàn)證。試驗(yàn)操作及藥敏結(jié)果參照2010年美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。所有Ab經(jīng)檢測鑒定后凍存于-80 ℃冰箱。藥敏試驗(yàn)所用質(zhì)控菌株為：大腸埃希菌ATCC25922、AbATCC19606。所有Ab菌株經(jīng)鑒定后保存于-80 ℃冰箱。

1.3.2細(xì)菌復(fù)蘇與蛋白質(zhì)提取將-80 ℃保存的40株Ab菌株常溫下放置30 min后接種于巧克力平板，6.5% CO2，35 ℃，培養(yǎng)16～24 h分離出純菌落。蛋白質(zhì)的提取采用有機(jī)溶劑沉淀提取法，在低溫下(4 ℃)進(jìn)行操作[3-5]。

1.3.3質(zhì)譜檢測與分析嚴(yán)格按照PBS Ⅱ C型蛋白指紋圖譜儀操作規(guī)程進(jìn)行操作，經(jīng)過樣品混合液的制備、芯片活化和點(diǎn)樣三個步驟。設(shè)置儀器運(yùn)行條件：開始檢測相對分子質(zhì)量為1 000×103；檢測最高限為100 000×103，優(yōu)化限為2 000×103～20 000×103；開始激光強(qiáng)度為200；開始檢測靈敏度為8；對結(jié)合在芯片表面的細(xì)菌蛋白質(zhì)進(jìn)行檢測，質(zhì)譜檢測采用標(biāo)準(zhǔn)蛋白對照液(胰島素，5 733.58)，二維內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行質(zhì)量控制[6]。使用Ciphergen Protein Chip軟件對蛋白質(zhì)質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以質(zhì)荷比((M/Z)為橫坐標(biāo)，以波峰強(qiáng)度(蛋白質(zhì)相對濃度)為縱坐標(biāo)繪制質(zhì)譜圖。BioMarker Wizard Software計(jì)算碳青霉烯類耐藥和敏感菌株的蛋白質(zhì)相對濃度，兩組蛋白質(zhì)峰值間比較采用t檢驗(yàn)，篩選出差異蛋白(P<0.05)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行聚類分析，根據(jù)數(shù)據(jù)特點(diǎn)選擇離差平方和聚類法(也稱Ward聚類法)。

2結(jié)果

2.1Ab蛋白質(zhì)指紋圖譜通過PBS Ⅱ C型蛋白指紋圖譜儀檢測結(jié)合在Au芯片上的Ab蛋白質(zhì)，獲得22株對碳青霉烯類藥物耐藥和18株對碳青霉烯類藥物敏感的菌株，Ab蛋白質(zhì)指紋圖見圖1。碳青霉烯類藥物耐藥與敏感菌株蛋白質(zhì)比較，24個蛋白質(zhì)峰差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，從其中篩選質(zhì)荷比分別為2 233.0、2 946.3、3 978.3、4 376.9、4 461.9、8 736.8的蛋白質(zhì)進(jìn)行聚類分析，見表1。

橫軸：質(zhì)荷比 AB33，碳青霉烯類藥物耐藥菌株；縱軸：峰強(qiáng)度 AB34,碳青霉烯類藥物敏感菌株。

圖1　　碳青霉烯類藥物耐藥與敏感Ab菌株蛋白指紋圖譜

MEAN：均值；SD：標(biāo)準(zhǔn)差；M/Z：質(zhì)荷比；R：碳青霉烯類藥物耐藥菌組；S：碳青霉烯類藥物耐敏感組。

表2　　22株Ab聚類分析

續(xù)表2　　22株Ab聚類分析

2.2聚類分析結(jié)果22株碳青霉烯類藥物耐藥的Ab聚類分析見圖2(見《國際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁“論文附件”)。橫軸為標(biāo)本之間的差異水平，縱軸代表聚類的標(biāo)本。在差異水平值(歐氏距離)為10時，聚類分析結(jié)果將22株碳青霉烯類藥物耐藥的Ab分成A型、B型，從圖2中可以看出碳青霉烯類藥物耐藥的Ab分布以A型為主，B型次之。A型又分為A1、A2兩個亞型，并以A1為主，B型也分為B1、B2兩個亞型，并以B2為主。22株Ab聚類分析見表2。

3討論

近年來，在微生物研究方面用SELDI-TOF-MS蛋白芯片技術(shù)已獲得越來越多有意義的成果。通過比較待測微生物和其他微生物的蛋白指紋圖譜，可以找到待測微生物的特異蛋白，通過比較某種細(xì)菌耐藥和敏感菌株的蛋白指紋圖譜可以分析該種細(xì)菌對某種藥物產(chǎn)生耐藥的蛋白質(zhì)組學(xué)原因。解春寶等[7]通過SELDI-TOF-MS技術(shù)建立銅綠假單胞菌蛋白指紋圖譜診斷模型，快速鑒定銅綠假單胞菌。黃文芳等[8]通過SELDI-TOF-MS技術(shù)為血流感染病原菌的快速鑒定提供了新思路。

余琳等[9]對分離自呼吸重癥監(jiān)護(hù)病房(RICU)的多重耐藥鮑曼不動桿菌(MDRAB)基因同源性進(jìn)行流行病學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)MDRAB曾在RICU有小范圍的爆發(fā)流行。本研究采用SELDI-TOF-MS技術(shù)分析碳青霉烯類藥物敏感與耐藥Ab的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示在相對分子質(zhì)量為2 000×103～20 000×103范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)峰中有24個差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。將差異蛋白經(jīng)過聚類分析顯示碳青霉烯類藥物耐藥的Ab分布以A型為主，B型次之，A型分為A1和A2兩個亞型，并以A1為主，B型也分為B1、B2。從聚類表中看到11和18號標(biāo)本系數(shù)最小，距離最近，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)最接近，被同時歸為A1型，經(jīng)查閱患者原始資料后發(fā)現(xiàn)2株Ab是在同一個月從同一科室患者痰液標(biāo)本分離而得，說明2株Ab間親緣最近，有可能來源于同一株Ab。8號和19號標(biāo)本系數(shù)僅次于11和18號標(biāo)本，蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)也很接近，聚類分析也被同時歸為A2型，查閱患者原始資料，也是在同一個月從同一科室患者痰液標(biāo)本分離而得，說明兩次分離所得的細(xì)菌也可能來源于同一株Ab。以上結(jié)果說明，本院臨床分離Ab曾在小范圍內(nèi)發(fā)生爆發(fā)流行，臨床醫(yī)生可通過本研究盡早了解本科室感染患者的互相感染，并采取措施預(yù)防和控制碳青霉烯類耐藥菌株的流行。

本研究利用SELDI-TOF-MS技術(shù)初步篩選了碳青霉烯類藥物敏感和耐藥的Ab差異蛋白，但能否將此差異蛋白分離、純化及鑒定，然后作為Ab碳青霉烯類藥物耐藥和敏感的蛋白標(biāo)志物，用于臨床的診斷與鑒別診斷的可行性尚需進(jìn)一步研究。雖然本試驗(yàn)只是一個初步研究，但為Ab碳青霉烯類藥物耐藥和敏感菌株的診斷與鑒別診斷方面的研究提供了新的方法和思路。

綜上所述，聚類分析碳青霉烯類抗菌藥物耐藥的Ab蛋白質(zhì)譜結(jié)果能夠判斷細(xì)菌親緣關(guān)系遠(yuǎn)近，可為Ab感染和臨床流行病學(xué)調(diào)查提供理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[1]胡付品，朱德妹，汪復(fù)，等．2013年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J]．中國感染與化療雜志，2014，14(5)：365-374．

[2]Manikal VM,Landman D,Saurina G,et al.Endemic carbapenem-resistant Acinetobacter species in Brooklyn,New York:citywide prevalence,interinstitutional spread,and relation to antibiotic usage[J].Clin Infect Dis,2000,31(1):101-106.

[3]Vanlaere E,Sergeant K,Dawyndt P,et al.Matrix-assisted laser desorption ionisation-time-of of-flight mass spectrometry of intact cells allows rapid identification of Burkholderia cepacia complex[J].J Microbiol Methods,2008,75(2):279-286.

[4]范鐵男，鄒積宏，盧行安，等．基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜技術(shù)用于常見益生菌鑒定的初步研究[J]．中國微生態(tài)學(xué)雜志，2010，22(10)：868-875．

[5] 徐昕榮，朱斌，馬瑜璐，等.MALDI-TOF-MS鑒定生物脫氮細(xì)菌的方法研究[J]．環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2010,33(10):148-161.

[6]丁銀環(huán)，胡瓊英，梁雙花．運(yùn)用內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)法提高表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜檢測中的重復(fù)性[J]．中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2009，32(3)：337-339．

[7]解春寶，肖代雯，楊永長，等．利用Au蛋白芯片技術(shù)快速鑒定銅綠假單胞菌的研究[J]．中華微生物學(xué)和免疫學(xué)雜志，2011，31(5)：462-466．

[8]黃文芳，肖代雯，楊永長，等．引起血流感染常見的革蘭氏陰性桿菌蛋白指紋圖譜的建立[J]．實(shí)用醫(yī)院臨床雜志，2012，9(3)：33-36．

[9]余琳，蘇丹虹，江鳳茹，等．多重耐藥鮑曼不動桿菌耐藥基因分析與同源性分析[J]．實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，42(12)：2018-2021．

The research on affinity of hospital separation carbapenems-resistant Acinetobacter*1

LiGuangrong,XiangChengyu,YangKui,LiuJinbo△

(DepartmentofClinicalLaboratory,theAffiliatedHospitalofLuzhouMedicalCollege，Luzhou,Sichuan646000,China)

Abstract:ObjectiveTo study the protein fingerprinting of carbapenems resistant and susceptible Acinetobacter baumannii (Ab) strains,investigate the clinical value of affinity distance in carbapenems resistant strains.MethodsA total of 22 carbapenems resistant Ab strains and 18 carbapenems susceptible Ab strains were collected,and bacterial protein fingerprinting was detected by surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry (SELDI-TOF-MS),differentially expressed proteins was analyzed by Biomarker Wizard 3.1.Cluster analysis of differential expressed proteins was conducted on SPSS 19.0.ResultsThe protein expression pattern of carbapenems resistant and sensitive Ab strains had significant difference(P<0.05).Cluster analysis showed carbapenems resistance Ab was given priority to with type A,followed by type B.ConclusionThe results of cluster analysis carbapenems resistance of Ab protein fingerprinting could determine the distance of affinity relationship of Ab.It could provide a theoretical basis for the infection and clinical epidemiology of Ab.

Key words:Acinetobacter baumannii;surface-enhanced laser desorption ionization time of flight mass spectrometry；cluster analysis；proteomics

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.009

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0740-03

基金項(xiàng)目：瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院基金資助項(xiàng)目(14035)。

作者簡介：李光榮，男，主管技師，主要從事微生物與生物化學(xué)檢驗(yàn)研究。(△)通訊作者，E-mail：liujb7203@163.com。