施秀英，王　琪，蔣钘鈺，徐　林，吳　杰，張　晨，袁　杰，鞠少卿

(1.南通大學附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇南通 226001；2.南通大學公共衛(wèi)生學院醫(yī)學檢驗系，江蘇南通 226019)

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·論著·

實時熒光定量聚合酶鏈反應檢測食管癌患者血清miR-100表達的意義*1

施秀英1，王琪2，蔣钘鈺2，徐林2，吳杰2，張晨2，袁杰2，鞠少卿1

(1.南通大學附屬醫(yī)院檢驗科,江蘇南通 226001；2.南通大學公共衛(wèi)生學院醫(yī)學檢驗系，江蘇南通 226019)

摘要:目的檢測食管癌患者與健康人血清中miR-100的表達量差異，并探討其作為食管癌分子診斷指標的可能性。方法采用實時熒光定量PCR方法，檢測40例食管癌患者(研究組)和50例體檢健康者(對照組)血清中miR-100的表達量，并進行統(tǒng)計學分析。結(jié)果研究組及對照組血清中miR-100的表達量分別為6.399±3.541、2.625±1.515，研究組明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.07，P<0.05)。用于食管癌患者診斷的miR-100的ROC曲線下面積為0.832(95%置信區(qū)間為0.731～0.934)，當Cut off值為5.285時，miR-100診斷食管癌的靈敏度和特異度分別為65%和95%。結(jié)論食管癌患者血清中miR-100表達較健康人高，有望成為該疾病輔助診斷的新分子標志物。

關鍵詞:食管癌；微小RNA；實時熒光定量聚合酶鏈反應

食管癌是一種常見的惡性腫瘤，其病死率在我國為惡性腫瘤疾病的第四位[1]。由于缺乏早期診斷的靈敏指標，食管癌患者多數(shù)起病隱匿、預后較差，所以早期診斷、早期預防對患者的治療及預后意義重大，但目前尚缺乏靈敏度及特異度高的血清檢測指標。微小RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的、約17～25 bp大小的非編碼單鏈小分子RNA，主要通過降解靶基因mRNAs或抑制靶基因蛋白翻譯參與轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控，對細胞分化、增殖、凋亡等多個過程有著重要的調(diào)控作用，其表達異常可導致某些疾病的發(fā)生，甚至形成腫瘤[2-3]。食管癌相關研究顯示食管癌患者中有多種miRNA表達異常，miRNA表達譜可區(qū)分正常組織和腫瘤，可作為患者的早期診斷，高危預警的指標[4-7]。本研究采用實時熒光定量PCR方法檢測miR-100在食管癌患者和健康人血清中的表達量，并探討其在食管癌診斷方面的意義。

1資料與方法

1.1一般資料2014年1～12月南通大學附屬醫(yī)院的食管癌患者40例納入研究組，其中男24例，女16例，年齡40～67歲，平均(56.8±8.9)歲，均未經(jīng)過放療或化療，且按世界衛(wèi)生組織(WHO)《病理組織學診斷標準(2007年)》確診。同期本院50例體檢健康者納入對照組，其中男28例，女22例，年齡41～65歲，平均(55.0±7.6)歲。2組研究對象年齡及性別差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2儀器與試劑7500 實時熒光定量PCR儀(美國ABI公司)；高速冷凍離心機(日本日立公司)；紫外分光光度計(德國IimPlen公司)；U6的逆轉(zhuǎn)錄引物，熒光定量PCR上、下游引物(廣州銳博生物科技有限公司)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國賽默飛公司)；RNA Master SYBR Green Ⅰ(瑞士羅氏公司)；mirVana PARIS Kit試劑盒(美國生命技術公司)。

1.3方法

1.3.1標本采集采集空腹靜脈血3 mL于惰性分離膠促凝管中，1 000 r/min離心10 min，將上層血清分裝至RNase-free的EP管中，冰盒運送，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2外周血總RNA的提取按照mirVana PARIS Kit試劑盒說明書操作提取RNA。用紫外分光光度計測得RNA濃度和純度，將提取完畢的總RNA標本凍于-80 ℃保存待用。

1.3.3引物處理miR-100與U6的逆轉(zhuǎn)錄引物、熒光定量PCR上、下游引物由廣州銳博生物科技有限公司合成。

1.3.4逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成miRNA的cDNA，收集逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，將其置于冰箱-20 ℃保存。

1.3.5實時熒光定量PCR按照miRNA實時定量檢測試劑盒說明書進行操作。每個擴增反應體系20 μL，包含SYBR Green Ⅰ Mix試劑10 μL，cDNA6 μL，上、下游引物各1 μL，以U6為內(nèi)參，反應條件為95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，58 ℃ 31 s，共40個循環(huán)。收集熒光，繪制溶解曲線，通過溶解曲線驗證產(chǎn)物的特異度。以經(jīng)過焦碳酸二乙酯(DEPC)處理的不含RNA模板的重蒸水(ddH2O)為陰性對照。每個標本做3個復孔，記錄每個反應管中的熒光信號到達閾值時所經(jīng)歷的PCR循環(huán)(Ct)值，以ROX為參比染料、U6為內(nèi)參照，采用實時熒光定量PCR中的相對定量法，以2-△△Ct表示miR-100基因表達的相對變化，即F=2 μ-△△Ct，△△Ct=研究組(CtmiR-100-CtU6)-對照組(CtmiR-100-CtU6)。

2結(jié)果

2.1實時熒光定量PCR檢測miR-100方法的建立

2.1.1線性關系取一份高值miR-100 cDNA作10倍梯度稀釋(1∶10、1∶100、1∶1 000、1∶10 000)，用實時熒光定量PCR檢測Ct值，繪制標準曲線，標準曲線方程為Y=-3.462X+19.612，R2=0.995，根據(jù)公式E=10-1/slope-1計算得出擴增效率E=0.983，見圖1，說明該檢測方法線性良好。

圖1　　熒光定量PCR檢測血清miR-100的標準曲線

2.1.2重復性選取同一份食管癌患者標本，在同批次熒光定量PCR中設置10個平行孔，進行miR-100cDNA和U6檢測，根據(jù)Ct值求得批內(nèi)變異系數(shù)(CV)= 0.43%。將同一標本連續(xù)進行10次實時熒光定量PCR檢測，批間CV=3.89%。

2.2miR-100的血清相對表達量檢測實時熒光定量PCR檢測食管癌患者血清miR-100的相對表達量為6.399±3.541，高于對照組的2.625±1.515，差異有統(tǒng)計學意義(t=9.07，P<0.05)。

2.3分析miR-100表達水平的診斷價值根據(jù)miR-100的結(jié)果繪制ROC曲線，見圖2，miR-100的AUC為0.832[95%置信區(qū)間(CI)為0.731～0.934]，Cut off 值取5.285時，其對食管癌輔助診斷的靈敏度和特異度分別為65%和95%。

圖2　　miR-100 ROC工作曲線

3討論

食管癌是發(fā)生在食管黏膜上皮組織的惡性腫瘤，是威脅我國民眾健康最為常發(fā)的惡性腫瘤之一。由于缺乏靈敏度較高、檢測方便的早期診斷指標，大多數(shù)患者就診時已處于中晚期，導致食管癌的治療及預后均不理想。

大量研究發(fā)現(xiàn)，miRNA在多種腫瘤組織中具有不同的表達譜。管曉翠[8]通過低密度芯片技術對食管癌患者和健康人血清中768種miRNA的表達量進行檢測，篩選出了21種miRNA在食管癌患者血清中明顯上調(diào)(2倍以上)，其中包括miR-100在內(nèi)的9種miRNA尤為明顯，變化倍數(shù)為1.57～6.42)。于萬濤等[9]的研究顯示miR-100不僅在多種腫瘤，如宮頸癌、前列腺癌、膀胱癌和肺癌等的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用，而且還可增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性。Sun等[10]對食管癌組織和細胞系的研究分析中顯示，術后惡性組織中miR-100的表達量明顯下調(diào)，可能是由于腫瘤組織的切除導致miR-100的表達量明顯下降。

miRNA在血液中相對比較穩(wěn)定，本研究利用血清中miR-100作為標志物，研究其在食管癌輔助診斷方面的意義。通過預實驗對于每個環(huán)節(jié)條件的摸索，本研究建立了一個完整檢測食管癌患者血清miRNA的熒光PCR體系。在提取食管癌患者血清總RNA后，選用U6作為內(nèi)參，應用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成miRNA的cDNA，實時熒光定量PCR方法檢測miR-100，其擴增曲線平行性好，擴增效率高，溶解曲線呈特異單峰(Tm=77.98 ℃)，提示本研究擴增特異度高，基本無引物二聚體及非特異性產(chǎn)物形成，方法學評價顯示本研究中的方法線性、重復性良好。食管癌患者中miR-100的表達量較對照組明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。ROC曲線分析顯示血清miR-100對食管癌有一定的診斷準確性，血清miR-100有望成為食管癌診斷的有效分子標志物。在以后的研究中需擴大研究病例數(shù)，并對患者進行長期隨訪，以全面評估m(xù)iR-100對食管癌的診斷、手術療效、預后等方面的臨床應用價值。

參考文獻

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[10]Sun J,Chen Z,Tan X,et al.MicroRNA-99a/100 promotes apoptosis by targeting mTOR in human esophageal squamous cell carcinoma[J].Med Onco,2013,30(1):411-420.

Value of real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction in detecting expression of miR-100 in patients with esophageal cancer*1

ShiXiuying1，WangQi2，JiangYanyu2，XuLin2，WuJie2，ZhangChen2，YuanJie2，JuShaoqing1

(1.DepartmentofClinicalLaboratory,AffiliatedHospitalofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226001,China;2.InspectionDepartment,PublicHealthSchoolofNantongUniversity,Nantong,Jiangsu226019,China)

Abstract:ObjectiveTo compare the expression of serum miR-100 in patients with esophageal cancer and healthy person,and explore the value of miR-100 in diagnosis for esophageal cancer.MethodsReal-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction was used to detecting miR-100 in 40 esophageal cancer patients(study group) and 50 healthy person(control group).ResultsThe expression of miR-100 in the study group and control group were 6.399±3.541,2.625±1.515 respective，the expression in the study group was significant higher than that of the control group(t=9.07，P<0.05).The under area of receiver operating characteristic curve of miR-100 in diagnosis for esophageal cancer was 0.832(95% confidence interval was 0.731-0.934)，when the Cut off value was 5.285，the sensitivity and specificity of miR-100 in diagnosis for esophageal cancer were 65% and 95%.ConclusionSerum miR-100 in esophageal cancer patients is higher than that in healthy person,which might be a new molecular markers in diagnosis for esophageal caner.

Key words:esophageal cancer;miR-100;real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction

(收稿日期：2015-12-20)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.008

文獻標識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0738-03

基金項目：南通大學大學生創(chuàng)新訓練計劃項目(201410304092X)。

作者簡介：施秀英，女，副主任技師，主要臨床血液學檢驗研究。