萬志丹，陳敬林，黃　湘，吳學(xué)威，李冬秀，楊海鑫

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院新生兒疾病篩查中心，廣東中山 528403)

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·論著·

濾紙干血片毛細(xì)管電泳技術(shù)在新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血篩查中的應(yīng)用*1

萬志丹，陳敬林，黃湘△，吳學(xué)威，李冬秀，楊海鑫

(南方醫(yī)科大學(xué)附屬中山博愛醫(yī)院新生兒疾病篩查中心，廣東中山 528403)

摘要:目的探討干血片毛細(xì)管電泳技術(shù)在新生兒α-珠蛋白生成障礙性貧血(以下簡稱α-地貧)篩查中的應(yīng)用價值。方法使用干血片毛細(xì)管電泳儀對46 718例新生兒足跟血濾紙干血片標(biāo)本進(jìn)行血紅蛋白(Hb)電泳分析，檢測HbA、HbF、HbA2和異常Hb的水平，對篩查表型陽性的病例召回進(jìn)行基因分析。結(jié)果46 718例新生兒足跟血濾紙干血片標(biāo)本中檢測出巴特血紅蛋白(Hb Bart′s)陽性者2 598例，篩查陽性率 5.56%(2 598/46 718)；召回544例經(jīng)基因分析確診477例α-地貧基因攜帶者，故Hb Bart′s帶篩查與基因確診的符合率為87.68%(477/544)。進(jìn)一步分析其臨床表型與Hb Bart′s水平的關(guān)系可見，隨著臨床表型的加重，Hb Bart′s水平逐漸增加，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.000)。結(jié)論濾紙干血片毛細(xì)管電泳分析技術(shù)與基因分析有較好的一致性，可根據(jù)Hb Bart′s水平的多少初步判斷α-地貧的臨床分型。

關(guān)鍵詞:干血片；毛細(xì)管電泳；α-珠蛋白生成障礙性貧血；新生兒

α-珠蛋白生成障礙性貧血(簡稱α-地貧)，是一種常見的遺傳性疾病[1]，主要流行于我國南方廣東[2]、廣西[3]及云南[4]等省份，由于此類疾病無有效的治療方法，產(chǎn)前篩查與診斷是有效阻止此類重型疾病胎兒出生的有效手段。本中心近年來將珠蛋白生成障礙性貧血(簡稱地貧)篩查納入新生兒疾病篩查體系，引進(jìn)全自動干血片毛細(xì)管電泳技術(shù)，用于對新生兒足跟血濾紙干血片的檢測，并對篩查表型陽性者召回進(jìn)行常見地貧基因的檢測分析，本研究就該系統(tǒng)的篩查價值報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料2014年6月至2015年5月，對包括本院在內(nèi)的全市25個接產(chǎn)機(jī)構(gòu)，在新生兒家屬知情同意情況下采集新生兒足跟血制作濾紙干血片標(biāo)本，共46 718份，送至本院新生兒疾病篩查中心，采用干血片毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行電泳篩查，對篩查陽性人群及時召回做地貧基因檢測。

1.2儀器與試劑全自動毛細(xì)管電泳采用法國Sebia公司的Capillarys2全自動毛細(xì)管電泳儀、配套血紅蛋白(Hb)電泳試劑盒Capillarys2 Hemoglobin(E)及質(zhì)控品進(jìn)行。采用PCR擴(kuò)增儀、分子雜交儀、電泳儀及α珠蛋白基因診斷試劑盒進(jìn)行基因分析，由深圳益生堂生物有限公司提供。

1.3方法

1.3.1電泳新生兒出生后3～5 d采集足跟血，按照Capillarys2全自動毛細(xì)管電泳儀的操作要求完成定標(biāo)、質(zhì)控和標(biāo)本檢測。

1.3.2基因檢測對召回的表型陽性病例采用多重斷裂點(diǎn)PCR(Gap-PCR)技術(shù)進(jìn)行最常見的東南亞型(--SEA)、右側(cè)缺失(-α3.7)、左側(cè)缺失(-α4.2)3種缺失型α-地貧及非缺失型α-地貧基因分析。

1.3.3評估方法新生兒足跟血濾紙干血片Hb電泳如出現(xiàn)異常Hb帶,即巴特血紅蛋白(Hb Bart′s)為α-地貧表型陽性。對表型陽性的病例進(jìn)行召回，并進(jìn)行基因檢測，以基因檢測作為參考方法，比較電泳篩查結(jié)果與基因檢測結(jié)果的符合率；分析常見臨床分型的Hb Bart′s水平分布。

2結(jié)果

2.1干血片Hb Bart′s篩查與基因診斷的符合率對干血片毛細(xì)管電泳篩查結(jié)果中含有Hb Bart′s的2 598例α-地貧表型陽性的病例召回了544例行基因確診，其中確診為α珠蛋白基因缺失477例，符合率為87.68%(477/544)。其中以--SEA/αα型構(gòu)成比最高，各基因型檢出數(shù)及構(gòu)成比情況見表1。

表1　　各基因型檢出數(shù)及其構(gòu)成比

2.2臨床分型與Hb Bart′s水平的分布對召回人群做進(jìn)一步的基因檢測，分析其臨床表型與Hb Bart′s水平的關(guān)系，由分析結(jié)果可見，隨著臨床表型的加重，Hb Bart′s水平逐步增加，4種臨床分型Hb Bart′s水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=223.167,P=0.000)，見表2。

表2　　臨床表型與Hb Bart′s水平的關(guān)系

3討論

α-地貧的產(chǎn)生機(jī)制主要是α-珠蛋白基因缺失或點(diǎn)突變造成α-珠蛋白鏈合成減少，造成非α-鏈相對過剩而形成四聚體，在新生兒期γ鏈形成四聚體，在Hb電泳中即表現(xiàn)為Hb Bart′s帶。因此，目前國內(nèi)外多常用毛細(xì)管Hb電泳來進(jìn)行地貧的篩查[5-7]。在新生兒α-地貧的篩查中，一般采用臍帶血進(jìn)行早期篩查[8]，臍血標(biāo)本不易采集、保存、運(yùn)送，臨床應(yīng)用受到一定的限制。與臍帶血比較，濾紙干血片具有更易長期保存，運(yùn)輸方便，對新生兒創(chuàng)傷小，且可與新篩項目同時檢測等特點(diǎn)，通過新篩網(wǎng)絡(luò)召回地貧基因診斷陽性的新生兒進(jìn)行遺傳咨詢，發(fā)放地貧基因攜帶卡片并給予識別，作為以后婚育和優(yōu)生指導(dǎo)的依據(jù)。及早檢出重型地貧及重度貧血兒，并給予合理治療，可提高患兒生活質(zhì)量。后期的規(guī)范化管理與干預(yù)將從根本上降低人群地貧基因的攜帶率，提高人口素質(zhì)。因此，濾紙干血片具有更廣泛的應(yīng)用前景。

已有研究報道使用Sebia公司Capillarys 2系統(tǒng)分析胎兒Hb，可替代DNA分析在產(chǎn)前確診Hb Bart′s，是一種簡單、快速、有效的方法[9]；Mantikou等[10]也認(rèn)為該系統(tǒng)在對新生兒Hb異常進(jìn)行篩查時，采用新鮮臍血和干血片，具有同樣好的效果。而臍帶血中Hb Bart′s帶增加與a-Hb鏈的缺陷存在相關(guān)性[11]，Rugless等[12]也指出Hb Bart′s帶是α-地貧篩查的一項敏感指標(biāo)。

為進(jìn)一步驗證 Capillarys 2干血片毛細(xì)管電泳儀檢測足跟血中的Hb Bart′s帶對α-地貧的篩查價值，本研究回顧性分析近年來本院新生兒足跟血濾紙干血片標(biāo)本的毛細(xì)管電泳結(jié)果及陽性召回的基因檢測結(jié)果，對該方法與基因檢測結(jié)果的符合率及各臨床表型的Hb Bart′s帶進(jìn)行分析。結(jié)果表明干血片篩查與地貧基因診斷的符合率達(dá)87.68%(477/544)，這稍低于葉立新等[13]報道的干血片篩查基因符合率(91.8%)，可能與本實驗室的陽性召回率過低有關(guān)。在篩查及確診病例中，以標(biāo)準(zhǔn)型α-地貧最多，這與本地區(qū)人群α-地貧基因攜帶率有關(guān)[14]。本研究并未檢出Hb Bart′s水腫胎患兒，表明本地區(qū)通過產(chǎn)前篩查和診斷在重癥地貧的防控上取得了一定成效。

本研究同時對α-地貧各臨床分型與Hb Bart′s帶水平間的關(guān)系進(jìn)行了探討，結(jié)果表明不同的臨床分型中，Hb Bart′s水平不同，隨著臨床表型的加重，Hb Bart′s水平逐漸增加，且臨床表型之間Hb Bart′s水平的差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。值得注意的是，本研究同時探討了非缺失型α-地貧，發(fā)現(xiàn)非缺失型α-地貧Hb Bart′s水平介于靜止型與標(biāo)準(zhǔn)型之間，因此臨床上應(yīng)注重對非缺失型α-地貧的篩查。本研究中各地貧臨床表型Hb Bart′s帶水平與臍血Hb Bart′s帶水平相比，相對較低，可能與本方法的篩查敏感性有關(guān)。

綜上所述，本研究通過回顧性分析濾紙干血片毛細(xì)管電泳與基因檢測結(jié)果的符合率，討論了臨床表型與Hb Bart′s帶水平的關(guān)系，表明該方法對新生兒α-地貧的篩查具有一定的臨床意義，但該方法在α-地貧中的篩查靈敏度、特異度等價值需進(jìn)一步研究進(jìn)行綜合評判。

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·論著·

Application of capillary electrophoresis by dried filter blood paper for screening of α-thalassemia in neonates*1

WanZhidan,ChenJinglin,HuangXiang△,WuXuewei,LiDongxiu,YangHaixin

(TheScreeningCenterforNeonatalDiseasesofBo′aiHospitalAffiliatedtoSouthernMedicalUniversity，Zhongshan，Guangdong528403,China)

Abstract:ObjectiveTo investigate the application of capillary electrophoresis by dried filter blood paper for screening of α-thalassemia in neonates.MethodsThe hemoglobin (Hb) of 46 718 cases of neonatal dried heel blood spots were analyzed by the capillary electrophoresis and the content of HbA,HbF,HbA2 and abnormal Hb were detected，the phenotype cases which was screened positive were recalled for genetic analysis.ResultsA total of 2 598 cases of Bart hemoglobin (Hb Bart′s) positive were detected in 46 718 cases of neonatal heel blood dried blood spots.The screening positive rate was 5.56% (2 598/46 718).A total of 477 cases of α-thalassemia gene carriers were confirmed by genetic analysis in the 544 cases which were recalled.The coincidence rate of Hb Bart′s screening and genetic diagnosis was 87.68%(477/544).By analyzing the relationship between the clinical phenotypes and the content of Hb Bart′s,we found the Hb Bart′s content gradually increased with the severity of clinical phenotype,and the difference was statistically significant(P=0.000).ConclusionThere is a good consistency between the capillary electrophoresis of dried filter blood paper and the genetic analysis.It could be determined α-thalassemia clinical type according to the Hb Bart′s content.

Key words:dried blood spots；capillary electrophoresis；α-thalassemia；neonates

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.06.005

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1673-4130(2016)06-0731-03

基金項目：中山市科技計劃項目(2014A1FC006);廣東省醫(yī)學(xué)科研基金項目(A2014890)。

作者簡介：萬志丹，女，副主任檢驗師，主要從事新生兒疾病篩查、產(chǎn)前篩查及診斷等相關(guān)研究。(△)通訊作者，E-mail:340382761@qq.com。