付穎聰，李小清，王紅雷，趙永清

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

白芨愈傷組織誘導(dǎo)研究

付穎聰，李小清，王紅雷，趙永清*

(西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730124)

目的：以白芨假鱗莖為培養(yǎng)材料，進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)和抗褐化研究.方法：使用蘭科常用培養(yǎng)基MS,B5，KC分別作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，應(yīng)用正交試驗(yàn)方法設(shè)計(jì)生長調(diào)節(jié)劑配比.結(jié)果：當(dāng)基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基時(shí)，并且6-BA 1.5 mg/L + 2，4-D 3.0 mg/L時(shí),愈傷組織誘導(dǎo)率最高，達(dá)73.3%.另外，添加活性炭可防止外植體褐化：活性炭含量為1.5 g/L時(shí)，褐化率為44%，愈傷組織誘導(dǎo)效果最好；活性炭含量為3.0 g/L時(shí)，褐化率最低為11%，愈傷組織誘導(dǎo)效果不好.結(jié)論：白芨愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L+2, 4-D 3.0 mg/L+AC 2 g/L.

白芨假鱗莖；愈傷組織誘導(dǎo)；激素；褐化

白芨(Bletilla striata Rchb.f.)為蘭科白芨屬多年生草本植物[1]，其花色艷麗，具有很高觀賞價(jià)值.全世界白芨屬植物有6種，其中中國就有4種，分別為白芨、小白芨(B.formosana Schltr.)、黃花白芨(B.ochracea Schitr)及華白芨(B.sinensis Schltr.)[2].同時(shí)，白芨假鱗莖是一種常用的中藥，具有止血收斂、消腫生肌之功效.主治肺結(jié)核咯血、支氣管擴(kuò)張咯血、胃潰瘍吐血、尿血、便血等癥; 外用治外傷出血、燒燙傷、手足皸裂等癥[3].現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，白芨假鱗莖的主要成分白芨膠還具有抑菌、抑癌、促凝血的功效和較強(qiáng)的抗氧化與抗衰老作用[4].由于白芨的藥用價(jià)值、觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其野生資源遭到過度采挖，加之其自然繁殖率低，生長緩慢，所以野生資源和普通種植已無法滿足市場需要.

目前，采用組織培養(yǎng)技術(shù)，建立愈傷組織誘導(dǎo)、增殖與分化體系是解決白芨資源短缺的途徑之一.關(guān)于白芨愈傷組織誘導(dǎo)的研究只見于石云平[5]的一篇文獻(xiàn).本實(shí)驗(yàn)利用白芨假鱗莖離體培養(yǎng)，誘導(dǎo)產(chǎn)生愈傷組織，解決誘導(dǎo)過程中外植體褐化與培養(yǎng)基類型選擇和激素配比的問題，為白芨的快速繁殖提供一定的理論依據(jù).

1 材料與試劑

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

白芨，于湖北省金航農(nóng)業(yè)合網(wǎng)絡(luò)科技有限公司購得.

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

本實(shí)驗(yàn)采用的White培養(yǎng)基、MS培養(yǎng)基、B5培養(yǎng)基及6-糠氨基嘌(KT)呤均來自北京索萊寶科技有限公司，為分析純.6-芐氨基嘌呤(6-BA)、2，4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)購自上海中秦化學(xué)試劑公司，為化學(xué)純.a-萘乙酸(NAA)購自上海山浦化工有限公司，為化學(xué)純.

1.3 實(shí)驗(yàn)主要儀器

立式壓力蒸汽滅菌器；潔凈工作臺SW-CJ-1F;蘇凈安泰；電子天平；自動(dòng)雙重純水蒸餾器；光照培養(yǎng)箱GZMGC-250P.

2 方法與步驟

2.1 外植體消毒滅菌

首先用自來水將白芨假鱗莖上泥沙洗刷干凈，并于洗衣粉水中浸泡約1 h，然后用蒸餾水沖洗3遍.在潔凈工作臺上先用70%酒精消毒30 s，雙蒸水沖洗3遍.再用0.1%氯化汞浸泡15 min，雙蒸水沖洗3遍.然后切成邊長為0.5 cm大小的正方體作為用于接種的外植體備用.

2.2 白芨愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基與激素配比的篩選

將消毒后的外植體分別接種到表1所示的三種培養(yǎng)基上，每瓶接三個(gè)外植體,每組做5瓶.植物生長調(diào)節(jié)劑2,4-D、NAA和6-BA添加量如下L9(34)正交表.培養(yǎng)pH值均調(diào)為5.8，含蔗糖3%，瓊脂0.7%，活性炭0.2%于(25±1)℃、光照強(qiáng)度1500lx、光照時(shí)間12 h/d、光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每周記錄一次生長狀況，九周后記錄誘導(dǎo)出愈傷組織外植體塊數(shù)，統(tǒng)計(jì)愈傷組織誘導(dǎo)率.

表1 白芨愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選及激素配比正交設(shè)計(jì)

愈傷組織誘導(dǎo)率=產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接入外植體數(shù).

瘦肉精是嚴(yán)重危害畜產(chǎn)品質(zhì)量安全的一種化學(xué)物質(zhì)。在動(dòng)物養(yǎng)殖中，需要針對瘦肉精殘留的危害性制定針對性的檢測技術(shù)，確保快速診斷，提高檢測效果，杜絕違法案件發(fā)生。本次研究的瘦肉精檢測卡具有很好的靈敏性，操作簡單、檢測時(shí)間短，在今后畜產(chǎn)品質(zhì)量瘦肉精殘留檢測方面，有較好的應(yīng)用價(jià)值。

2.3 外植體的抗褐化

在愈傷組織誘導(dǎo)過程中，采用的2，4-D是植物組培常用合成植物生長素，當(dāng)它在植物體內(nèi)累積濃度超過2.0 mg/L時(shí)，出現(xiàn)嚴(yán)重的褐化現(xiàn)象[6].實(shí)驗(yàn)中將外植體接入添加了1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、3.0 g/L活性炭(AC)的MS+6-BA1.5 mg/L +NAA 3.0 mg/L培養(yǎng)基上，以不加活性炭的MS+6-BA1.5mg/L +NAA 3.0 mg/L培養(yǎng)基為對照組，探索白芨愈傷組織誘導(dǎo)及活性炭抗褐化的最佳濃度.

3 結(jié)果及分析

3.1 白芨愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基與激素配比的篩選結(jié)果

表2 白芨愈傷組織培養(yǎng)激素正交結(jié)果分析

從表1可知，相同的激素配比組合，只有MS培養(yǎng)基誘導(dǎo)出了愈傷組織.由表2的分析結(jié)果可以看到，最佳的誘導(dǎo)激素配比為6-BA 1.5 mg/L+2, 4-D 3.0 mg/L+NAA 0 mg/L.影響誘導(dǎo)率最大的因素是6-BA濃度.其次是2，4-D濃度.這兩種激素對愈傷組織的誘導(dǎo)在一定濃度范圍內(nèi)具有明顯的促進(jìn)作用.NAA對愈傷組織的誘導(dǎo)也具有一定影響，但影響效力要小于6-BA和2,4-D，并且對愈傷組織誘導(dǎo)具有抑制作用.

圖1 (MS)培養(yǎng)第三周時(shí)的假鱗莖 圖2 (MS) 培養(yǎng)第九周時(shí)的假鱗莖

如圖1所示，培養(yǎng)到三周，我們可以明顯看到6號外植體邊緣變得不在平齊，并出現(xiàn)透明膨大細(xì)胞；當(dāng)培養(yǎng)到第九周時(shí)(如圖2)，6號培養(yǎng)基中出現(xiàn)淡黃色致密的愈傷組織，而15號、18號和25號培養(yǎng)基中外植體在第九周時(shí)依然處于圖1的狀態(tài).培養(yǎng)期間由于培養(yǎng)基的消耗，我們繼代培養(yǎng)四次.

將外植體接到抗褐化誘導(dǎo)愈傷組織的培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示.活性炭在濃度為3 g/L以下時(shí)，抗褐化效果隨濃度增加而增加，愈傷組織的誘導(dǎo)效果在濃度為1.5 g/L時(shí)最好，原因如下：當(dāng)活性炭濃度低于1.5 g/L時(shí)，褐化率較高，不利于誘導(dǎo)愈傷組織；而當(dāng)活性炭濃度高于1.5 g/L時(shí)，褐化率低.但由于活性炭屬于多孔結(jié)構(gòu)，具有很強(qiáng)的吸附性，含量過高會(huì)大量吸收培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)及激素，外植體缺乏營養(yǎng)物質(zhì)從而導(dǎo)致組織壞死，將更加不利于愈傷組織誘導(dǎo).

表3 愈傷組織抗褐化結(jié)果

4 討論

一定量的生長素類物質(zhì)是植物愈傷組織誘導(dǎo)的必要條件.本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)的方法，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，明確6-BA與2,4-D是獲得高質(zhì)量愈傷組織的關(guān)鍵因子，不過6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)的影響更大，這與石云平等[5]白芨愈傷組織誘導(dǎo)、增殖與分化研究結(jié)果有所不同.實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，NAA對愈傷組織的誘導(dǎo)具有抑制作用.同時(shí)，由于我們選擇了2 g/L的活性炭作為抗氧化劑，培養(yǎng)基的有效成分會(huì)有一些被活性炭吸附，因此本實(shí)驗(yàn)中的6-BA與2,4-D的最佳激素濃度會(huì)偏高，同時(shí)也降低了NAA對誘導(dǎo)效果的影響.

[1] 藥典委員會(huì)．中華人民共和國藥典：一部[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010.95.

[2] 石晶.白芨屬植物資源與利用[D].?？冢汉Ｄ洗髮W(xué)，2010.

[3] 陸俊波,李亞輝,楊永紅,孫樂樂,夏翔，等.從文獻(xiàn)分析看我國白芨研究進(jìn)展[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，26(2)：288-292.

[4] 芮海云,吳國榮,陳景耀,等.白芨中性多糖抗氧化作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].南京師范大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2003, 26(4): 94-98.

[5] 石云平，趙志國，唐鳳鸞，等.白芨愈傷組織誘導(dǎo)、增殖與分化研究[J].中草藥，2013,28(6)：349-353.

[6] 魯光耀，楊仙，蔣瑞彬，蔣福升，錢朝東，丁志山.白芨組培快繁體系研究[J].浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2015,39(5)：383-390.

Study on Induction of Bletilla Striata Callus

FU Ying-cong, LI Xiao-qing, WANG Hong-lei, ZHAO Yong-qing*

(College of Life Science and Engineering, Northwest University for Nationalities, Lanzhou 730030, China)

Objective：In order to study the anti-browning and induction of Bletilla striata callus by taking the false bulbs of Bletilla Striata as tissue culture material. Methods：The medium of MS, B5 and KC were selected as the basic culture medium of orchidaceae respectively. The ratio of growth regulators was adjusted via orthogonal tests. Results：The induction ratio was the maximum of 73.3% when MS medium was used as basic culture medium with 6-BA 1.5 mg/L+NAA 0mg/L+2,4-D 3.0 mg/L. Additionally, addition the activated carbon into the basic culture medium could prevent Bletilla striata browning. The browning rates were 44% and 11% when the contents of activated carbon were 1.5 g/L and 3.0g/L. The induction efficacy of Bletilla striata callus was the highest and least for both contensts respectively. Conclusion：The optimal medium for induction of callus was MS+1.5mg/L of 6-BA+0mg/L of NAA +3.0 mg/L of 2,4-D +2g/L of AC.

False bulbs of Bletilla Striata; Induction of callus; Hormone; Browning

2016-11-02

西北民族大學(xué)國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目(項(xiàng)目編號：201610742074).

*

付穎聰(1994—)，女，湖北襄陽人.

S567.239

A

1009-2102(2016)04-0016-04