張 宇，傅義程，王 瑞，趙曉靜，蔡鐘奇，陳 曦，徐 斌，趙 穎，李 泱*

（1解放軍總醫(yī)院心內(nèi)科，北京 100853；2解放軍第451醫(yī)院門急診科，西安 710054）

心臟的正常起搏點位于竇房結(jié)[1]，竇房結(jié)起搏細胞的自發(fā)性搏動調(diào)控心臟的正常生理活動，細胞膜上各種離子通道的復雜活動構(gòu)成竇房結(jié)電生理機制的基礎[2?4]。病態(tài)竇房結(jié)綜合征[5,6]以≥65歲老年人多見，發(fā)病率約為0.17%。竇房結(jié)細胞（sinoatrial node cells，SNC）為節(jié)律性活動細胞，其動作電位（action potential，AP）幅度小，無動作電位平臺，靜息電位絕對值低，4期不穩(wěn)定，存在緩慢地自動除極[7,8]。研究表明，快激活延遲整流鉀電流（IKr）對于該類細胞的復極起著重要作用，直接關(guān)系到細胞的搏動頻率，從而對心率和節(jié)律產(chǎn)生主要的作用。

丹參酮Ⅱ（sodium tanshinoneⅡA sulfonate，STS）是從丹參根中提取并分離出的二萜醌類化合物，是丹參中的主要有效成分，具有抗心肌缺氧、抗心律失常功效[9?11]。但目前尚未知STS是否對SNCIKr電流存在作用。故本研究應用STS對IKr電流的作用，觀察藥物對其效應及可能的通道門控機制，以期為其降低病態(tài)竇房結(jié)綜合征的發(fā)生機制提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM細胞培養(yǎng)基（Thermo公司），胰蛋白酶1∶250、胰蛋白酶?EDTA消化液（Sigma公司），羥乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、二甲基亞砜（Amresco公司），胎牛血清（fatal bovine serum，F(xiàn)BS）、Opti-MEM無血清細胞培養(yǎng)基（Invitrogen公司）。

1.2 溶液配制

記錄AP的電極內(nèi)液（mmol/L）：K-Aspartate 120，KCl 20，MgCl25，Na2ATP 5，HEPES 10，KOH調(diào)pH值至7.2。記錄AP的細胞外液（mmol/L）：NaCl 137，CaCl21.8，KCl 4，MgCl21，HEPES 10，葡萄糖10，pH值用NaOH調(diào)至7.4；記錄IKr電流電極內(nèi)液成分（mmol/L）：KCl 130，MgCl21，MgATP 5，EGTA 5，HEPES 10，pH值用KOH調(diào)至7.2。記錄IKr電流細胞外液（mmol/L）：NaCl 110，KCl 30，CaCl21.8，MgCl21，HEPES 10，葡萄糖5，NaOH調(diào)pH值至7.4。并加入阻斷劑4-AP 50μmol/L阻斷超快激活鉀電流（IKur），阻斷劑CdCl2100μmol/L阻斷L型鈣電流（ICa,L），阻斷劑BaCl2100μmol/L阻斷鈉電流（INa）。0.08%胰蛋白酶配制（g/L）：胰蛋白酶0.8，NaCl 8，NaHCO30.353，葡萄糖0.991，KCl 0.298，HEPES 2，無菌條件下，用0.22μm濾膜過濾除菌，4℃冰箱保存。

1.3 乳鼠竇房結(jié)細胞的分離與培養(yǎng)

將出生24h內(nèi)的Wistar大鼠10只，消毒后仰臥位固定，開胸暴露心臟。解剖顯微鏡下分離心包膜，于界嵴中部靜脈竇側(cè)、前腔靜脈根部取2mm×2mm×2mm的組織塊于DMEM中，吹打5次，于PBS液中剪成0.3mm×0.3mm×0.3mm小塊，吸棄上清。加0.08%胰蛋白酶8ml，37℃水浴中震蕩5min，吹打1min，沉淀后吸棄上清。加0.025%Ⅱ型膠原酶8ml，37℃水浴中震蕩10min，吹打1min，沉淀后吸取上清于含20ml的15%FBS的DMEM 50ml的離心管中，重復消化3次，每次7min。940r/min離心7min。棄上清加培養(yǎng)液，將單細胞懸液接種于60mm的培養(yǎng)皿中，臺盼藍檢測活細胞率達95%以上。37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育90min，差速貼壁以除去成纖維細胞，后加5?溴脫氧尿嘧啶核苷（5-BrdU）使其終濃度為0.1mmol/L并繼續(xù)培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，在膜片鉗放大器的全細胞模式下，以電流鉗方式記錄SNC自發(fā)AP。

1.4 藥物灌流方法

將分離出的乳鼠SNC分為兩組：對照組和STS組，對照組細胞未進行干預，STS組細胞應用STS 30μmol/L灌流。STS購于索萊寶試劑公司，純品是無色的，相對分子質(zhì)量為162。將STS用二甲基亞砜溶解，并制備成儲備液，臨用時采用細胞外液稀釋成結(jié)果部分所示終濃度。采用局部灌流裝置于細胞外恒流灌流方式給藥，為確保藥物效應的一致性，待平衡5min后方可記錄電流。同時，將空白溶解STS所需體積的二甲基亞砜溶液加入細胞外液，未發(fā)現(xiàn)對電流有影響。

1.5 全細胞膜片鉗的電流記錄

在倒置顯微鏡下，選擇邊緣清楚、表面光滑、梭形細胞。將Axon-700B膜片鉗放大器同計算機連接。刺激信號及電壓輸入信號的采集應用Digidata 1440A數(shù)模轉(zhuǎn)換器，均由軟件（pCLAMP10.2）控制。GG-17玻璃毛坯經(jīng)pp-83微電極拉制儀拉制成入液電阻為2.0～5.5MΩ的電極。電極入液后進行液接電位補償校正，使其至＜（±2）mV，調(diào)節(jié)三維操縱器使電極尖端移向細胞表面進行封接，使電阻達1GΩ以上形成高阻封接，進行快電容補償以消除儀器引入的電容誤差。采用脈沖式方式負壓吸破細胞膜形成全細胞記錄模式。測定電容時，施以0.4V/s的斜坡刺激，測電流并按方程Cm＝Ⅰ/（dV/dt）計算（Cm為膜電容，Ⅰ為電流值，dV/dt即電壓斜率）。

采用全細胞膜片鉗記錄方法，在電流鉗模式下，不給任何刺激，記錄自發(fā)性AP；在電壓鉗制下記錄IKr電流。為消除細胞間的誤差，Ⅰ值以電流密度（pA/pF）表示。信號經(jīng)截止頻率為1kHz的四階貝塞爾低通濾波器濾波，采樣率為5kHz。串聯(lián)電阻補償90%～95%以消除電壓偏差；應用儀器自動進行慢電容補償約為85%～90%，細胞實驗在室溫下（22℃～24℃）進行。

1.4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS15.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)處理采用pCLAMP 9.2處理，兩組間數(shù)據(jù)比較采用獨立樣本的t檢驗，多組間數(shù)據(jù)比較用ANOVA方差分析，組間兩兩比較用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞起搏頻率的作用

選取梭形細胞，在電流鉗模式下，不給任何電信號刺激，記錄細胞自發(fā)性AP。圖1所示，在無任何電流刺激下，可記錄到自發(fā)性AP。與對照組比較，應用10μmol/LSTS后，自動除極加快。細胞的搏動頻率增加，從對照組的（157.2±10.3）次/min增加至STS組的（268.1±12.6）次/min（P＜0.01）。

圖1 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞起搏頻率的作用Figure 1 Effects of STS on the frequency of SNCs beatSTS:sodium tanshinoneⅡA sulfonate.A:the spontaneous action potentials of SNCs;B:comparison of beating frequency in control group and STS group.Compared with control group,**P＜0.01

2.2 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr電流的作用及濃度依賴性

保持電位?40mV，施予+20mV，2000ms的去極化脈沖，記錄IKr的時間依賴性電流（IKr,step），脈沖復極至?40mV時，時間為2000ms，記錄IKr的尾電流（IKr,tail）。STS可以使竇房結(jié)細胞IKr,tail電流密度顯著增加，在去極化為+60mV時，對照組細胞的IKr,tail電流密度為（54.6±4.7）pA/pF，而應用30μmol/LSTS后，IKr,tail電流密度增加至（86.3±8.3）pA/pF（P＜0.01；圖2A）。

將終濃度為1，3，10，30，100μmol/L的STS加入細胞外液，給予細胞與2.2相同的去極化電流刺激，觀察藥物對IKr電流的影響，發(fā)現(xiàn)其作用呈濃度依賴性特征，半數(shù)有效濃度（EC50）為（29.3±1.02）μmol/L，Hill系數(shù)為1.05（圖2B）。

2.3 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr作用的電壓依賴性

保持電位?40mV，施予?50mV～+60mV，2000ms的去極化脈沖，記錄IKr,step電流，脈沖復極至?40mV時，時間為2000ms，記錄IKr,tail。分別測量各組SNC在各電壓時對應的IKr電流值，計算電流密度，并繪制Ⅰ-Ⅴ曲線圖。結(jié)果表明，該電流隨著刺激脈沖向去極化移動，IKr,step電流呈現(xiàn)出明顯的內(nèi)向整流特征，IKr,tail電流在+10mV以上呈現(xiàn)出的穩(wěn)態(tài)現(xiàn)象。應用30μmol/L STS后使IKr,tail電流密度增加，尤其是在?10mV以上增加更加顯著（圖3）。

2.4 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr穩(wěn)態(tài)激活和失活曲線的影響

保持電位?80mV，施予?60mV～+40mV，2000ms的去極化脈沖，階躍為10mV，脈沖復極至?40mV時，時間為2000ms，記錄IKr,tail。將尾電流標準化，以各電壓下的刺激脈沖為橫軸，以標準化尾電流為縱軸作圖（圖4A）。并用Boltzmann方程（I/Imax＝1/{1+exp[（V1/2?Vm）/k]}）進行曲線擬合求出半激活電壓（V1/2,act）和激活曲線k值。30μmol/L STS灌流使V1/2,act由（?9.7±1.7）mV左移至（?17.8±3.4）mV（P＜0.01）；k值由（12.5±0.4）mV變?yōu)椋?0.9±0.2）mV。

保持電位?80mV，施予+40mV，500ms的預刺激，緊接著給予?120mV～+20mV，階躍10mV，50ms的快速脈沖，緊接著在每一條件脈沖后緊跟一固定去極化至+40mV，2000ms的測試脈沖，記錄IKr,tail。標準化各電流幅值，以相對電流對各膜電位作圖得穩(wěn)態(tài)失活曲線（圖4B）。用Boltzmann方程（I/Imax＝1/{1+exp[（Vm-V1/2）/k]}）進行曲線擬合求出半失活電壓（V1/2,inact）。30μmol/L STS灌流后，V1/2,inact由（?54.1±2.9）mV移至（?57.8±4.3m）V，k值由（21.0±2.3）mV變?yōu)椋?2.5±3.6）mV。

圖2 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr電流的作用Figure 2 The effects of STS on IKrcurrents of SNCsSTS:sodium tanshinoneⅡA sulfonate.A:the concentration dependency of STS on SNCs;B:the effects of STS on tail currents of IKr;C:comparison of tail current densities in control group and STS group.Compared with control group,*P＜0.05

圖3 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr作用的電壓依賴性Figure 3 The voltage dependency of STS on SNCsSTS:sodium tanshinoneⅡA sulfonate.A:the voltage dependency of STS on step currents of IKrin two groups.B:the voltage dependency of STS on tail currents of IKrin two groups

2.5 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr失活后恢復時間常數(shù)的影響

保持電位?80mV，施予+40mV，2000ms的預刺激，緊接著給予一個?120mV～?40mV，階躍10mV，4000ms的系列測試脈沖，記錄IKr,tail。按單項指數(shù)式{I（t）＝A0[1-exp（1-t/τ）]}求算各電壓下的失活后恢復時間常數(shù)（τ），以復活時間常數(shù)相對各膜電位作圖得復活時間常數(shù)電壓依賴性曲線（圖5）。在各測試電壓下，30μmol/L STS顯著加速IKr失活后恢復（P＜0.05）。

圖4 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr穩(wěn)態(tài)激活和失活曲線的影響Figure 4 Effects of STS on the steady-state curves of activation and inactivation of IKrcurrentSTS:sodium tanshinoneⅡA sulfonate.A:effects of STS on the steady-state curves of activation of IKrcurrent;B:effects of STS on the steady-state curves of inactivation of IKrcurrent

3 討 論

圖5 STS對乳鼠竇房結(jié)細胞IKr失活后恢復的影響Figure 5 Effects of STS on the recovery after inactivation curves of IKrcurrentSTS:sodium tanshinoneⅡA sulfonate

本實驗首先發(fā)現(xiàn)，中藥單體STS對于SNC均有明顯地增加細胞自律性的作用。我們知道，在竇房結(jié)疾病特別是竇性心律延緩或病態(tài)竇房結(jié)綜合征時，SNC的自動節(jié)律性明顯降低[12]，心臟起搏異常，以致產(chǎn)生一系列心律失常，甚至導致血流動力學障礙[1,5,6]。而我們發(fā)現(xiàn)STS具有良好的加快SNC搏動的效應。丹參及其提取物已廣泛用于治療各種心血管疾病，Shan等[13]研究表明STS降低大鼠心肌梗死后心律失常發(fā)生率，減少室速和室顫的發(fā)生和持續(xù)時間，顯著降低心肌梗死大鼠的死亡率。Sun等[14]研究表明HEK293細胞中STS能直接激活人IKr通道。我們之前研究表明，STS可以增加自發(fā)性高血壓大鼠腸系膜動脈大電導鈣激活鉀通道（large conductance calcium-activated potassium channel，BKCa）電流的幅度和密度，且其激活作用呈電壓依賴及濃度依賴性特征。鑒于此，本實驗結(jié)果提示該藥物對病態(tài)竇房結(jié)綜合征等心律失?？赡芫哂泻芎玫膽们熬?。

本實驗還發(fā)現(xiàn)，STS增加細胞自律性的原因主要與其縮短單細胞AP時程有關(guān)，而后者與藥物明顯升高IKr,tail電流密度關(guān)系密切。我們知道，IKr,tail電流作為竇房結(jié)起搏細胞的主要復極電流，參與AP快速相的形成。該通道的激活可以使AP時程縮短，自動除極加快，細胞的搏動頻率增加。病理狀態(tài)下，諸多原因?qū)е翴Kr,tail電流減少，引起AP時程明顯延長，細胞起搏頻率降低。我們的研究結(jié)果顯示，STS通過增加IKr,tail電流密度，顯著縮短AP時程，進而加速了竇房結(jié)細胞的搏動頻率。

通道門控機制研究結(jié)果顯示，STS增加電流的效應主要與其使通道穩(wěn)態(tài)激活曲線負移，加速通道激活有關(guān)。與對照組相比，STS組的穩(wěn)態(tài)激活曲線向超極化方向移動，使半激活電壓更接近靜息電位，通道更易被激活。另外，也與藥物在加快通道失活后恢復有密切關(guān)系。STS組SNCIKr,tail失活后恢復動力學加速，恢復時間常數(shù)縮短。提示在應用STS后，IKr通道將從失活狀態(tài)迅速恢復。由于上述兩種機制，導致STS顯著增加IKr,tail電流。

眾所周知，離子通道多分布于細胞膜上，之前需經(jīng)過合成、遷移和定位過程[15,16]。而藥物是否經(jīng)過影響上述過程，還需進一步研究證明。盡管如此，本實驗提供了STS通過增加IKr,tail電流，進而增加SNC自律性效應的結(jié)果。這對于降低病態(tài)竇房結(jié)綜合征等心律失常的新藥研發(fā)提供了部分實驗依據(jù)。

【參考文獻】

[1]Wu Y,Anderson ME.CaMKⅡ in sinoatrial node physiology and dysfunction[J].Front Pharmacol,2014,5:48.

[2]Perde FV,Atkinson A,Yanni J,et al.Morphological characteristics of the sinus node on postmortem tissue[J].Folia Morphol(Warsz),2015.doi:10.5603/FM.a2015.0087.[Epub ahead of print]

[3]Chen J,Makiyama T,Wuriyanghai Y,et al.Cardiac sodium channel mutation associated with epinephrine-induced QT prolongation and sinus node dysfunction[J].Heart Rhythm,2015.pii:S1547-5271(15)01035-8.doi:10.1016/j.hrthm.2015.08.021.[Epub ahead of print]

[4]Faggioni M,van der Werf C,Knollmann BC.Sinus node dysfunction in catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia:risk factor and potential therapeutic target[J]?Trends Cardiovasc Med,2014,24(7):273?278.

[5]Walsh-Irwin C,Hannibal GB.Sick sinus syndrome[J].AACN Adv Crit Care,2015,26(4):376?380.

[6]Morris GM,Kalman JM.Fibrosis,electrics and genetics.Perspectives in sinoatrial node disease[J].Circ J,2014,78(6):1272?1282.

[7]Zhao J,Liu T,LiG.Relationship between two arrhythmias: sinus node dysfunction and atrial fibrillation[J].Arch Med Res,2014,45(4):351?355.

[8]Kelder TP,Vicente-Steijn R,Harryvan TJ,et al.The sinus venosus myocardium contributes to the atrioventricular canal: potential role during atrioventricular node development[J]? J Cell Mol Med,2015,19(6):1375?1389.

[9]Wei B,Li WW,Ji J,et al.The cardioprotective effect of sodium tanshinoneⅡA sulfonate and the optimizing of therapeutic time window in myocardial ischemia/reperfusion injury in rats[J].Atherosclerosis,2014,235(2):318?327.

[10]Zhang MQ,Zheng YL,Chen H,et al.Sodium tanshinoneⅡA sulfonate protects rat myocardium against ischemia-reperfusion injuryviaactivation of PI3K/Akt/FOXO3A/Bim pathway[J].Acta Pharmacol Sin,2013,34(11):1386?1396.

[11]Shang Q,Wang H,Li S,et al.The effect of sodium tanshinoneⅡA sulfate and simvastatin on elevated serum levels of inflammatory markers in patients with coronary heart disease:a study protocol for a randomized controlled trial[J].Evid Based Complement Alternat Med,2013,2013:756519.

[12]Schweizer PA,Schroter J,Greiner S,et al.The symptom complex of familial sinus node dysfunction and myocardial noncompaction is associated with mutations in the HCN4 channel[J].J Am Coll Cardiol,2014,64(8):757?767.

[13]Shan H,Li X,Pan Z,et al.TanshinoneⅡA protects against sudden cardiac death induced by lethal arrhythmiasviarepression ofmicroRNA-1[J].BrJ Pharmacol,2009,158(5):1227?1235.

[14]Sun DD,Wang HC,Wang XB,et al.TanshinoneⅡA:a new activator of human cardiac KCNQ1/KCNE1[(I(Ks)]potassium channels[J].Eur J Pharmacol,2008,590(1?3):317?321.

[15]Yang KC,Nerbonne JM.Mechanisms contributing to myocardial potassium channel diversity,regulation and remodeling[J]. Trends Cardiovasc Med,2015. pii:S1050-1738(15)00183-8.doi:10.1016/j.tcm.2015.07.002.[Epub ahead of print]

[16]Moric-Janiszewska E,Glogowska-Ligus J,Paul-Samojedny M,et al.Expression of genes KCNQ1 and HERG encoding potassium ion channelsIkr,Iksin long QT syndrome[J].Kardiol Pol,2011,69(5):423?429.