王 芳

（安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司，安徽蚌埠 233010）

松口蘑 ［Tricholoma matsutake（S.Ito et lmai）Sing］，又稱(chēng)松茸（日本）、松菇（朝鮮族）等，屬擔(dān)子菌亞門(mén)（Basidiomycota）、層菌綱（Hymenomycetes）、口蘑目（Tricholomatales，或傘菌目 Agaricales）、口蘑科（Tricholomaceae），口蘑屬[1]（Tricholoma）。它生長(zhǎng)于海拔1600～2600 m的溫帶和寒溫帶松樹(shù)與櫟樹(shù)混交林帶的林地。在國(guó)外主要分布于朝鮮、日本、美國(guó)、加拿大和北歐國(guó)家；在中國(guó)的主產(chǎn)區(qū)為東北地區(qū)和西南地區(qū)[2-4]。松口蘑菇體肥大、肉質(zhì)鮮嫩、香味誘人，而且營(yíng)養(yǎng)豐富，有“菇中之王”的美稱(chēng)[5]。目前，國(guó)內(nèi)外較多集中在對(duì)松口蘑多樣性分析[6]、RAPD反應(yīng)體系的優(yōu)化、產(chǎn)地生態(tài)環(huán)境調(diào)查及菌種分離繁殖[7]、培養(yǎng)技術(shù)開(kāi)發(fā)、功能成分分析和評(píng)價(jià)等方面的研究。

食用菌的風(fēng)味物質(zhì)也是當(dāng)前研究熱點(diǎn)之一。如陳志杰等從靈芝菌絲體中檢測(cè)出包括烯烴和醛類(lèi)等在內(nèi)的58種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。何喆等采用頂空微萃取（HS-SPME）與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）的方法分析，結(jié)果表明：液體培養(yǎng)樟芝菌絲體和固體培養(yǎng)樟芝菌絲體的揮發(fā)性化合物組成相似，僅各化合物的相對(duì)含量不同。松口蘑子實(shí)體中的香味成分已初步研究，我們前期較系統(tǒng)地分析了深層發(fā)酵法獲得松口蘑發(fā)酵醪中所含的揮發(fā)性香味物質(zhì)。

本研究通過(guò)深層發(fā)酵技術(shù)制備松口蘑菌絲體，并在優(yōu)化了相關(guān)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件下，采用頂空進(jìn)樣-固相微萃取技術(shù)收集松口蘑培養(yǎng)基及發(fā)酵后期揮發(fā)性香味成分，利用GC-MS技術(shù)對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行全組分分析，獲得不同培養(yǎng)基的松口蘑發(fā)酵醪中所含主要揮發(fā)性物質(zhì)的種類(lèi)和含量，并進(jìn)行比較，為進(jìn)一步培養(yǎng)和開(kāi)發(fā)松口蘑香味物質(zhì)的產(chǎn)品提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌種

松口蘑菌種由安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司菌種室提供。

1.2 培養(yǎng)基的配方

以葡萄糖，KH2PO4，MgSO4為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同組分配制100 mL培養(yǎng)基，見(jiàn)表1。

表1 各實(shí)驗(yàn)組不同培養(yǎng)基組成 g

1.3 接種

將超凈臺(tái)紫外燈打開(kāi)滅菌30 min后關(guān)閉，每組接入2瓶菌種。搖瓶培養(yǎng)10 d，溫度25℃，搖瓶轉(zhuǎn)速160 r/min。

1.4 固相微萃取

松口蘑發(fā)酵10 d后，收集發(fā)酵醪，勻漿后取8 mL樣品放入15 mL帶聚四氟乙烯瓶蓋的進(jìn)樣瓶，將初次使用的石英纖維萃取頭在氣相色譜的進(jìn)樣口老化至無(wú)雜峰，老化溫度250℃，老化時(shí)間2 h；取5 mL處理后的樣品，加入70 μL壬酸甲酯溶液作為內(nèi)標(biāo)，一起加入15 mL干凈樣品瓶中，用磁力攪拌器50℃下預(yù)熱10 min，插入萃取頭，先將萃取頭鞘插入樣品瓶中，推動(dòng)手柄桿使萃取頭伸出，萃取20 min后取出。

1.5 氣相色譜-質(zhì)譜的條件

1.5.1 氣相色譜的條件 采用DB-1701色譜柱，柱長(zhǎng)30 m，內(nèi)徑0.25 mm，厚度0.25 μm，高純He流量1 mL/min，不分流，進(jìn)樣口溫度250℃，解析20 min；起始溫度35℃，保持5 min，以5℃/min上升至150℃，保持5 min，再以3℃/min升至240℃，保持20 min。

1.5.2 質(zhì)譜條件 質(zhì)譜接口溫度280℃，離子源溫度230℃，電離方式70 eV，掃描質(zhì)量范圍33～450 amu。數(shù)據(jù)收集用HP化學(xué)工作站軟件對(duì)照NIST庫(kù)進(jìn)行，成分先由譜庫(kù)初步鑒定，再結(jié)合化學(xué)成分的保留時(shí)間、質(zhì)譜、實(shí)際成分和保留指數(shù)等進(jìn)行定性。定量采用內(nèi)標(biāo)法相對(duì)定量。待萃取達(dá)平衡后，縮回萃取頭，轉(zhuǎn)移至氣相色譜進(jìn)樣器中，推出萃取頭解吸3 min，進(jìn)行色譜分析。

2 結(jié)果與分析

采用固相微萃取技術(shù)收集接種前的培養(yǎng)基及接種后發(fā)酵醪揮發(fā)性香味成分，GC-MS法對(duì)揮發(fā)性化合物進(jìn)行全組分分析，采用面積歸一化法進(jìn)行相對(duì)定量，松口蘑揮發(fā)性香味物質(zhì)經(jīng)GC-MS分析的結(jié)果見(jiàn)表2和表3。

由表2可知，接種前各組培養(yǎng)基中所含揮發(fā)性成分種類(lèi)均較少，主要是4-硝基-4'-氯二苯砜，表明培養(yǎng)基本身對(duì)揮發(fā)性香味物質(zhì)貢獻(xiàn)不大。對(duì)比表2和表3中不同實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵前后揮發(fā)性物質(zhì)種類(lèi)和含量的變化可以看出，發(fā)酵前1號(hào)培養(yǎng)基中，揮發(fā)性物質(zhì)有2種，分別為4-硝基-4'-氯二苯砜和1，2-苯二甲酸-丁基-8-甲基壬基酯；而經(jīng)10 d松口蘑發(fā)酵后，其發(fā)酵醪中有31種香味物質(zhì)。2號(hào)培養(yǎng)基僅有一種揮發(fā)性成分，為1，2-苯二甲酸-丁基環(huán)己基酯；而發(fā)酵醪中共有28種香味物質(zhì)，其中C16物質(zhì)較多。發(fā)酵前3號(hào)培養(yǎng)基中含有3種揮發(fā)性物質(zhì)，分別為1，2-苯二甲酸-丁基-8-甲基壬基酯、4-硝基-4'-氯二苯砜、己二酸-雙（2-乙基己基）酯；其發(fā)酵醪中共有香味物質(zhì)22種，以醇類(lèi)及酯類(lèi)較多，同時(shí)，培養(yǎng)基中揮發(fā)性物質(zhì)均已被利用或轉(zhuǎn)化，表明添加酵母膏之后有利于松口蘑的生長(zhǎng)和代謝。而對(duì)比4號(hào)培養(yǎng)基發(fā)酵前后揮發(fā)性成分可以看出，發(fā)酵過(guò)程合成出28種香味物質(zhì)，其中C16、C18化合物較多，而培養(yǎng)基中的4-硝基-4'-氯二苯砜已被利用或轉(zhuǎn)化。發(fā)酵前5號(hào)和6號(hào)培養(yǎng)基中均含有鄰苯二甲酸二異丁酯，而發(fā)酵后該成分經(jīng)轉(zhuǎn)化后濃度顯著降低。7號(hào)培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵后共產(chǎn)出24種物質(zhì)，含量均相對(duì)較高。而8號(hào)培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵后，產(chǎn)出24種揮發(fā)成分，培養(yǎng)基中的4-硝基-4'-氯二苯砜均已被轉(zhuǎn)化。

表2 培養(yǎng)基揮發(fā)性物質(zhì)

綜合對(duì)比表3可以得知，7組培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵后均產(chǎn)有苯乙醇、2-甲基-5-（1-甲基乙烯基）-2-環(huán)己烯-1-醇、4，4'（1-甲基亞乙基）雙苯酚，可初步判定為松口蘑發(fā)酵主要香味物質(zhì)。

結(jié)合表1的培養(yǎng)基組成和表3發(fā)酵后揮發(fā)性成分種類(lèi)和含量可以看出，含有豆餅粉的1、2、3、4、5培養(yǎng)基發(fā)酵后都有D-苧烯，判斷其為豆餅粉發(fā)酵特征物質(zhì)。8號(hào)培養(yǎng)基中沒(méi)有豆餅粉但其發(fā)酵醪有D-苧烯，推測(cè)為玉米漿、玉米粉、酵母膏三者混合后發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生某些與豆餅粉的相似成分。含有玉米漿的 1、3、5、6、8 培養(yǎng)基發(fā)酵后均產(chǎn)生環(huán)類(lèi)化合物，故推測(cè)玉米漿與雜環(huán)化合物的形成有關(guān)。含有玉米粉的2、4、5、7、8培養(yǎng)基經(jīng)發(fā)酵后，發(fā)酵醪中均含有癸醛，判斷其為玉米粉發(fā)酵特征香味物質(zhì)。1號(hào)培養(yǎng)基中沒(méi)有玉米粉，發(fā)酵醪也產(chǎn)生癸醛，可能是從順式-4-癸烯醛轉(zhuǎn)化而來(lái)。

表3 各組培養(yǎng)基松口蘑發(fā)酵醪中揮發(fā)性香味物質(zhì)的GC-MS分析結(jié)果

續(xù)表3

3 結(jié)論

本研究基于固相微萃取與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（GC-MS）法鑒定了不同培養(yǎng)基組成對(duì)松口蘑發(fā)酵醪揮發(fā)性成分的影響。其中，發(fā)酵前多數(shù)培養(yǎng)基中主要含有的揮發(fā)性成分為4-硝基-4'-氯二苯砜。培養(yǎng)基組成對(duì)松口蘑發(fā)酵醪的揮發(fā)性成分的種類(lèi)和含量影響顯著，其中，添加豆餅粉和玉米粉有利于苧烯和癸醛等揮發(fā)性成分的合成，而添加玉米漿有利于雜環(huán)化合物類(lèi)揮發(fā)性成分合成。本研究為進(jìn)一步了解食用菌揮發(fā)性香味物質(zhì)合成和代謝途徑提供一定的參考。

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