郭燦，曾莉

疏肝健脾方含藥血清對酒精性損傷HepG2細胞脂肪變性的保護作用

郭燦，曾莉

目的探討疏肝健脾方含藥血清對酒精性損傷HepG2細胞脂肪變性的保護作用。方法采用酒精誘導HepG2細胞損傷模型，設立正常對照組、模型組、含藥血清組（疏肝健脾方含藥血清）和正常血清組，觀察HepG2細胞形態(tài)以及生長情況；采用MTT法檢測細胞活力，采用油紅O染色對存活HepG2細胞脂肪變程度進行觀察和量化比較，采用免疫印跡法檢測HepG2細胞過氧化物酶體增殖物激活受體（PPAR）γ蛋白表達水平。結果含藥血清組細胞形態(tài)與正常對照組HepG2細胞形態(tài)相似，細胞形態(tài)完整，貼壁生長狀態(tài)良好；含藥血清組和正常對照組HepG2細胞脂肪變程度十分接近，脂肪變程度較輕；油紅O染色顯示，異丙醇溶液脫色后吸光度測定值在模型組為（0.942±0.051），正常血清組為（0.928±0.049），均顯著高于含藥血清組（0.619±0.043）和正常對照組【（0.621± 0.050，P＜0.05】；MTT吸光度值在正常對照組為（1.021±0.071），在含藥血清組為（0.962±0.066），也顯著高于模型組（0.561±0.035）和正常血清組【（0.572±0.041），P＜0.05】；正常對照組和含藥血清組HepG2細胞PPARγ蛋白表達水平顯著低于模型組和正常血清組（P＜0.05）。結論疏肝健脾方含藥血清對酒精性損傷HepG2細胞脂肪變性有保護作用。

酒精性脂肪肝；HepG2細胞；疏肝健脾方；脂肪代謝

長期過量飲酒會對肝臟造成嚴重的損傷，主要是因為乙醇會大量地消耗輔酶和細胞色素，嚴重影響肝臟的代謝功能，進而使肝臟脂肪堆積，形成酒精性脂肪肝或肝炎[1，2]。酒精性脂肪肝的形成機制主要為乙醇在肝臟內代謝而產生的高反應性羥自由基和脂質過氧化反應對肝臟組織造成嚴重的損傷[3，4]。近年來，中醫(yī)藥治療酒精性脂肪肝逐漸顯示出其低毒、安全、有效的特點，越來越多的酒精性脂肪肝患者獲得了中醫(yī)藥治療。疏肝健脾方是由柴胡、半夏、草決明、何首烏、澤瀉、葛根、生山楂、丹參、茯苓、陳皮等十味中藥組成。臨床研究表明其對酒精性脂肪性肝炎有顯著的治療效果[5]。關于疏肝健脾方對酒精性脂肪肝的保護作用機制尚未見有相關報道。本研究以酒精損傷HepG2細胞模擬酒精性肝損傷模型，觀察疏肝健脾方含藥血清對酒精損傷細胞的保護作用，進而揭示其保護作用的機制，為疏肝健脾方更好地應用于酒精性脂肪肝的治療提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞、動物、試劑與藥物HepG2細胞株由山東大學醫(yī)學院細胞生物學研究所提供。健康SD大鼠24只，雌雄各半，體質量為200～260 g（安徽省實驗動物中心）。胎牛血清、MTT、DMSO、胰蛋白酶（美國Sigma公司），兔抗鼠過氧化物酶體增殖物激活受體(Peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ）多克隆抗體（Bioworlde公司），酒精（天津化工廠），疏肝健脾方各位藥材購自我院中藥房。酶標儀、電泳儀（Hoefer Amersham Biosciences公司）、倒置顯微鏡（德國EPPENDORF公司）。

1.2 含藥血清制備將SD大鼠分為對照組和疏肝健脾方組，每組12只。給予對照組大鼠蒸餾水灌胃，給予試驗組疏肝健脾方湯劑（柴胡10 g、半夏10 g、草決明15 g、何首烏15 g、澤瀉15 g、葛根15 g、生山楂20 g、丹參20 g、茯苓20 g、陳皮12 g）35.47 g.kg-1(體積為10 ml/kg），分別于早8點和晚8點灌胃，連續(xù)3 d，在最后一次灌胃1 h后，經腹主動脈抽血，離心，分離血清，將含藥血清保存在-80℃?zhèn)溆?。其中對照組所得血清為正常血清。

1.3 HepG2損傷模型的建立及疏肝健脾方含藥血清的保護作用觀察實驗分為正常對照組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞）、模型組（正常培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2受損細胞）、正常血清組（正常血清培養(yǎng)HepG2受損細胞）和含藥血清組（含藥血清培養(yǎng)HepG2受損細胞）。取HepG2細胞，培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基（含有鏈霉素60 μg/ml、青霉素100 U/ml、10%胎牛血清），待細胞貼壁后，分別在不同組中加入正常培養(yǎng)基、正常血清和含藥血清培養(yǎng)12 h，加入酒精300 nmol/ml，培養(yǎng)2 h，造成細胞損傷。然后，吸出各孔內的培養(yǎng)液，加入酒精處理2 h，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，用10%甲醛對HepG2細胞固定10 min，用油紅O對固定后的HepG2細胞染色20 min，在顯微鏡下對油紅O染色結果進行拍照，用60%異丙醇對染色后的油紅O進行萃取，萃取時間為10 min，使用酶標儀（Multiskan FC賽默飛世爾）檢測異丙醇萃取液的吸光度，其中最大吸收波長為510 nm。正常對照組、模型組、正常血清組和含藥血清組各4孔，重復上述實驗3次。

1.4 細胞增殖檢測采用MTT法，在96孔板中將正常對照組、模型組、正常血清組和含藥血清組各設置12個孔，并設置6個調零孔。如上述培養(yǎng)細胞，棄去每孔中的損傷液，更換基礎培養(yǎng)基100 μl，加入MTT溶液20 μl，培養(yǎng)4 h后棄去每孔內的基礎培養(yǎng)液和MTT溶液，每孔加入DMSO 100 μl，振蕩10 min，在490 nm波長下檢測吸光度值。

1.5 HepG2細胞PPARγ蛋白表達水平檢測采用Western blotting法檢測，酒精處理細胞2 h后，用胰酶消化，收集正常對照組、模型組、正常血清組和含藥血清組細胞，加入細胞裂解液在碎冰中裂解，裂解后高速低溫離心，吸取離心后的上清液，按照4:1的比例加入Loading buffer（5×），在沸水中煮沸。使用凝膠電泳儀對總蛋白進行分離，將目的蛋白轉膜至NC醋酸纖維素膜上，在5%脫脂奶粉溶液中封閉1 h，洗膜3次，加入兔抗鼠PPARγ多克隆抗體，在4℃條件下孵育過夜，漂洗3次，加辣根過氧化物酶標記的二抗，在常溫下孵育2 h，洗膜3次，涂抹ECL發(fā)光試劑，暗室內曝光，拍照，分析目的蛋白和內參蛋白的灰度值。

1.6 統(tǒng)計學處理應用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以（x±s）表示，采用單因素方差分析比較各組數(shù)據(jù)間的差異，采用兩兩配對的t檢驗進行組間比較，以P＜0.05為具有統(tǒng)計學差異。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學變化在相差顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)疏肝健脾方含藥血清干預的HepG2細胞形態(tài)與正常HepG2細胞形態(tài)十分接近，細胞形態(tài)完整，貼壁生長良好；模型組和正常血清組HepG2細胞出現(xiàn)萎縮或者腫脹變形，形態(tài)飽滿程度降低，細胞數(shù)量顯著減少（圖1）。

圖1 細胞形態(tài)的變化（200×）A：正常組；B：酒精損傷組；C：含藥血清組；D：正常血清組

2.2 HepG2細胞脂肪變情況經過紅油O染色后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)含藥血清組和正常對照組HepG2細胞脂肪變較輕；模型組和正常血清組HepG2細胞脂肪變程度較重，主要表現(xiàn)為細胞層次出現(xiàn)嚴重的紊亂，細胞密集區(qū)域細胞脂肪變程度較重；模型組和正常血清組經異丙醇溶液脫色后，吸光度測定值顯著高于含藥血清組和正常對照組（P＜0.05，表1和圖2）。

表1 各組吸光度測定值（s）比較

表1 各組吸光度測定值（s）比較

與正常對照組比，①P＜0.05；與模型組比，②P＜0.05

吸光度正常組0.621±0.050模型組0.942±0.051①含藥血清0.619±0.043②正常血清0.928±0.049①

圖2 HepG2細胞形態(tài)表現(xiàn)（油紅O染色，200×）A：正常對照組；B：模型組；C：含藥血清組；D：正常血清組

2.3 細胞增殖情況MTT檢測結果顯示，正常對照組和含藥血清組細胞增殖活躍，而模型組和正常血清組細胞增殖減退（表2）。

表2 各組細胞吸光度值±s）比較

表2 各組細胞吸光度值±s）比較

與正常對照組比，①P<0.05；與模型組比，②P<0.05

吸光度正常對照1.021±0.071模型組0.561±0.035①含藥血清0.962±0.066②正常血清0.572±0.041①

2.4 各組HepG2細胞PPARγ蛋白表達比較經過Western blotting法檢測，結果表明，正常對照組和含藥血清組HepG2細胞PPARγ蛋白表達水平顯著低于模型組和正常血清組（P＜0.05，圖3）。

圖3 各組HepG2細胞PPARγ蛋白表達水平A：正常對照組；B：模型組；C：含藥血清組；D：正常血清組

3 討論

肝臟是人體重要的代謝器官，是身體脂類物質代謝的主要場所。長期過量飲酒則會對肝臟造成嚴重的損傷，如肝細胞對脂類物質的合成、攝取增加，而同時對脂類物質轉運和利用程度降低，最終造成脂肪在肝細胞內堆積，形成酒精性脂肪肝[6，7]。中醫(yī)對酒精性脂肪肝也有相關描述。中醫(yī)認為過量飲酒或過食肥甘味厚會導致痰濁滋生，痰濕內停，導致瘀滯氣機，瘀阻血脈，最終導致濁、痰、血、氣在體內相互搏結，聚滯成積[8，9]。中醫(yī)對酒精性脂肪肝的治療原則為疏肝健脾、活血行氣、化脂消痰[10，11]。本研究所采用的疏肝健脾方是由柴胡、半夏、草決明、何首烏、澤瀉、葛根、生山楂、丹參、茯苓、陳皮組成。方中的草決明具有清肝醒脾之作用，何首烏具有補肝益脾之作用，柴胡和丹參具有利膽活血、疏肝解郁之作用，澤瀉具有泄熱利濕之作用，生山楂具有消積化瘀之作用，陳皮和半夏具有燥濕化痰之作用，茯苓具有健脾滲濕化痰之作用，葛根具有解酒之作用。各位中藥合用達到疏肝健脾、活血化瘀以及消痰化積之作用。目前，已有研究表明疏肝健脾方對酒精性脂肪肝患者具有顯著的治療效果。

本研究以酒精損傷HepG2細胞來體外復制酒精性脂肪肝損傷模型，并且用疏肝健脾方含藥血清干預損傷后的HepG2細胞，以研究疏肝健脾方對酒精性脂肪肝的保護作用及保護作用的機制。已有研究證明酒精對肝臟的損傷主要是損傷肝細胞內的氧化環(huán)節(jié)[12，13]，但是疏肝健脾方對酒精性脂肪肝細胞代謝過程的影響還未完全清楚。在本研究中，疏肝健脾方含藥血清可以減弱酒精對HepG2細胞形態(tài)的影響；疏肝健脾方含藥血清干預后細胞增殖增強，減輕細胞脂肪變程度，拮抗酒精損傷所導致的HepG2細胞凋亡，疏肝健脾方含藥血清對酒精損傷的HepG2細胞有顯著的保護作用。

PPAR是人體重要的轉錄因子，該轉錄因子需要配體激活后才能表現(xiàn)出生物活性。PPAR有三種亞型，分別為PPARα、PPARβ、PPARγ，這三種亞型在機體中的分布和功能是不同的，其中與脂類物質代謝十分相關的是PPARγ[14，15]。研究表明，正常肝細胞PPARγ表達量僅為脂肪組織的10%～20%[16，17]。PPARγ主要表達的部位是白色和棕色脂肪組織，如小腸組織，多種脂肪酸和脂肪酸衍生物可以激活PPARγ[18，19]。PPARγ蛋白表達水平及活性對調控脂類和糖類物質代謝起重要作用，PPARγ可以通過不同途徑調控脂類代謝相關基因的表達，進而達到調控細胞分化以及脂肪在體內代謝的目的[20]。因此，PPARγ在脂肪細胞分化過程中的作用研究越來越被學者們所重視。在本研究中，疏肝健脾方含藥血清可以顯著降低酒精損傷HepG2細胞PPARγ蛋白表達量，說明疏肝健脾方對酒精損傷HepG2細胞的保護作用機制可能為通過降低HepG2細胞內的PPARγ蛋白表達，從而調整HepG2細胞內的脂肪合成速度。

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（收稿：2015-07-11）

（本文編輯：陳從新）

Effect of Shuganjianpi decoction in the prevention of alcohol-induced steatosis in HepG2 cells

Guo Can, Zeng Li.
Department of Chinese Herbal Pharmacy,Fifth People’s Hospital,Chengdu 611130,Sichuan Province, China

Objective To explore the effect of Shuganjianpi decoction in the prevention of alcoholinduced steatosis in HepG2 cells in vitro.Methods Cellular injury of HepG2 cells were induced by alcohol treatment,and HepG2 cells were divided into four groups,e.g.control group(group A）,alcohol-treated group (group B）,serum containing Shuganjianpi decoction treated group(group C）and normal serum treated group (group D）.Cellular morphology and growth were observed.Cell viability was tested by MTT assay.The degree of steatosis in viable cells was evaluated by Oil red O staining,and the expression of peroxisome proliferatoractivated receptor-γ(PPAR-γ）was detected by Western blotting assay.Results The cells in group A and group C had similar morphological manifestations and good performance of adherence,and similar mild extent of steatosis; Oil red O staining revealed that after the decolorization by isopropyl alcohol solution,absorbance value in group B (0.942±0.051）and group D(0.928±0.049）were significantly higher than those in group C(0.619±0.043）or in group A[(0.621±0.050）,P<0.05];MTT assay showed that the absorbance value in group A(1.021±0.071）and group C(0.962±0.066）were significantly higher than in group B(0.561±0.035）and group D[(0.572±0.041）, P<0.05];The expression of PPARγprotein decreased in group A and group C than in group B and group D did (P<0.05）.Conclusions The effect of Shuganjianpi decoction is effective in the prevention of alcohol-induced steatosis in HepG2 cells.

Alcoholic fatty liver;HepG2 cell;Shuganjianpi decoction;Lipid metabolism

10.3969/j.issn.1672-5069.2016.02.009

611130 成都市第五人民醫(yī)院中藥房

郭燦，女，46歲，大學本科，副主任中藥師。研究方向：中藥學。E-mail:guocanqaz@163.com