麻秋霞，胡海濤，王耀邦

(縉云縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江縉云 321400)

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血凝抑制試驗(yàn)中兩種鴨血清非特異性凝集因子去除方法的效果比較

麻秋霞，胡海濤，王耀邦

(縉云縣動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，浙江縉云 321400)

摘要：非特異性凝集現(xiàn)象，是干擾血凝抑制試驗(yàn)的重要因素。本次試驗(yàn)因非特異性凝集而無(wú)法判定結(jié)果的比例占20%，采用紅細(xì)胞沉淀吸附預(yù)處理法去除鴨血清中的非特異性血凝素及鴨血球直接測(cè)定法進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)，均有較好去除非特異性凝集因子的效果，去非率達(dá)66%，且所得效價(jià)與常規(guī)檢測(cè)法相比，無(wú)明顯差異。

關(guān)鍵詞：血凝抑制試驗(yàn)；非特異性凝集因子；鴨血清

血凝抑制試驗(yàn)是免疫檢測(cè)工作中比較常用的一種試驗(yàn)方法。因受某些非特異性血凝因子的影響，故在試驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)遇到鴨血清對(duì)雞紅細(xì)胞懸液的非特異性凝集，造成試驗(yàn)結(jié)果判定時(shí)，因紅細(xì)胞不流淌或流淌不完全而無(wú)法作出正確判斷。

為尋求一種能有效消除非特異性凝集因子，又便于實(shí)際應(yīng)用的檢測(cè)方法，筆者進(jìn)行了用雞紅細(xì)胞沉淀吸附預(yù)處理法和同源鴨紅細(xì)胞直接測(cè)定法檢測(cè)去除非特異性凝集因子的效果試驗(yàn)，取得了理想成效，現(xiàn)介紹如下。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)用紅細(xì)胞分別采自3只同種健康公雞和番鴨，按常規(guī)方法，經(jīng)PBS洗滌離心后，分別配制成1%和5%雞紅細(xì)胞懸液和1%鴨紅細(xì)胞懸液，備用。

1.1.2試驗(yàn)血清番鴨血清75份，從縉云縣不同地區(qū)5個(gè)鴨場(chǎng)中隨機(jī)采集。

1.1.3禽流感H5亞型(R-6)血凝抑制試驗(yàn)抗原由哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司生產(chǎn)，批號(hào)2013004。

1.2試驗(yàn)方法

1．2．1試驗(yàn)設(shè)計(jì)通過(guò)雞紅細(xì)胞懸液對(duì)鴨血清的血凝抑制試驗(yàn)，得出非特異性凝集數(shù)，再以雞紅細(xì)胞懸液與吸附處理后的鴨血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)、鴨紅細(xì)胞懸液與鴨自然分離血清的血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)兩法作出去除非特異性凝集因子效果的評(píng)估。

1.2.2非特異性凝集現(xiàn)象認(rèn)定以血球凝集抑制試驗(yàn)結(jié)果判定時(shí)，各孔血球均不流淌為準(zhǔn)、如有在倍比稀釋后的前數(shù)孔凝集、后流淌者則不記入本試驗(yàn)的非特異性凝集范圍。

1.2.3血清中非特異性凝集因子處理采集1份待檢血清加入等量5%雞紅細(xì)胞懸液，靜置30 min或4℃過(guò)夜，10000 r/min離心5 min后，取上清液待檢。

1.2.4血球凝集試驗(yàn)分別進(jìn)行1%雞紅細(xì)胞懸液和1%鴨紅細(xì)胞懸液的血球凝集試驗(yàn)，配制4單位工作抗原。

1.2.5抗原標(biāo)定采用反向滴定法標(biāo)定工作抗原濃度。

1.2.6操作方法

試驗(yàn)一：(常規(guī)檢測(cè)法)采用1%雞紅細(xì)胞懸液與鴨血清進(jìn)行血球凝集抑制試驗(yàn)。

試驗(yàn)二：(紅細(xì)胞吸附法)采用1%雞紅細(xì)胞懸液與鴨吸附后血清進(jìn)行血球凝集抑制試驗(yàn)。

試驗(yàn)三：(鴨紅細(xì)胞直接測(cè)定法)采用1%鴨紅細(xì)胞懸液與鴨血清進(jìn)行血球凝集抑制試驗(yàn)。

詳細(xì)操作按高致病性禽流感診斷技術(shù)GB/T18936-2003規(guī)范進(jìn)行。

1.2.7試驗(yàn)成立條件陰性對(duì)照孔血清滴度不大于2log2，陽(yáng)性孔對(duì)照血清誤差不超1個(gè)滴度。

1.2.8判定標(biāo)準(zhǔn)將一次性反應(yīng)板傾鈄45°，空白對(duì)照孔血球?yàn)閷?duì)照，以完全流淌的血清最高稀釋倍數(shù)為HI滴度。

2結(jié)果與分析

2.11%雞紅細(xì)胞懸液與鴨血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)結(jié)果據(jù)試驗(yàn)檢測(cè)，因非特異性凝集而無(wú)法判定結(jié)果者15份、占20%，且有13份集中于同一養(yǎng)殖場(chǎng)戶。如以雞紅細(xì)胞懸液對(duì)鴨血清進(jìn)行HI試驗(yàn)則無(wú)法對(duì)其結(jié)果作出正確判斷。

2.2吸附處理法和鴨血球直接測(cè)定法的去非特異性血凝效果比較據(jù)試驗(yàn)，兩法均有10個(gè)樣本血清完全去除了非特異性凝集現(xiàn)象，去非率達(dá)66%。詳見(jiàn)表1。

表1　吸附法和直接測(cè)定法去非效果比較

注：帶﹟號(hào)表示非特異性凝集

由表1可見(jiàn)，在10個(gè)被去除非特異性血凝抑制現(xiàn)象的血清樣本中，有6個(gè)樣本的測(cè)定效價(jià)完全相同。不同的4個(gè)樣本中，有3個(gè)樣本鴨血球直接測(cè)定法的測(cè)定效價(jià)比采用吸附法的測(cè)定值高1效價(jià)，即有稍高的靈敏度。

2．3三種檢測(cè)方法試驗(yàn)結(jié)果的可靠性分析如以常規(guī)檢測(cè)法效價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)，其它兩法則與其有較高的符合率。詳見(jiàn)表2。

表2　三種檢測(cè)方法試驗(yàn)結(jié)果的可靠性分析

由表2可見(jiàn)，以試驗(yàn)1(常規(guī)檢測(cè)法)的效價(jià)為標(biāo)準(zhǔn)，試驗(yàn)2與試驗(yàn)1比較：有11組樣本效價(jià)相同，其余有4組相差±1效價(jià)；2組高1效價(jià)，2組低1效價(jià)，兩者差異不顯箸(P>0.05)。試驗(yàn)3與試驗(yàn)1組比較有11組樣本效價(jià)相同，其余有4組相差±1效價(jià)；3組高1效價(jià)，1組低1效價(jià)，兩者差異不顯箸(P>0.05)。試驗(yàn)3與試驗(yàn)2比較有11組樣本效價(jià)相同，其余有4組相差±1效價(jià)；3組高1效價(jià)，1組低1效價(jià)，兩者差異不顯箸(P>0.05)。

綜上所述，相應(yīng)的三種檢測(cè)方法試驗(yàn)結(jié)果，其差異不顯著(P>0.05)。即采用吸附法和鴨血球直接測(cè)定法所得結(jié)果基本可信。

3小結(jié)與討論

3．1本次雞紅細(xì)胞和鴨血清進(jìn)行的血凝抑制試驗(yàn)，因非特異性凝集而無(wú)法判定結(jié)果者占20%，且主要集中在同一個(gè)群體，如果不去除非特異性凝集，則無(wú)法對(duì)試驗(yàn)結(jié)果作出正確評(píng)判。

3．2采用雞紅細(xì)胞沉淀吸附法和鴨紅細(xì)胞直接測(cè)定法，均能大部去除鴨血清中的非特異性凝集因子，能基本滿足一般檢測(cè)的精度要求，兩者比較，各有優(yōu)缺點(diǎn)：如用吸附法，則可用統(tǒng)一濃度的工作抗原和無(wú)需配制另一種血球懸液，但工作量較大，耗時(shí)較長(zhǎng)。直接測(cè)定法，比吸附法則有稍高靈敏度，但僅能用于鴨血清。

3．3血凝抑制試驗(yàn)中，用于吸附法的雞血球濃度和應(yīng)用比例較多，筆者為了精確效價(jià)計(jì)算故選用了本試驗(yàn)中的比例參數(shù)，有否影響去非率，有待進(jìn)一步研究探討。

3．4試驗(yàn)證實(shí)三種測(cè)定方法，除試驗(yàn)1中的非特異性凝集外，其他效價(jià)的誤差較小，結(jié)果可信。

中圖分類號(hào)：S852.5+2

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-7307(2016)02-0008-002