劉　健，馬義濤，潘俊龍，翁巧琴，張金枝*

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司)

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獺兔成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(FGF5)基因的多態(tài)性研究

劉健1，馬義濤1，潘俊龍1，翁巧琴2，張金枝1*

(1.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江杭州 310058；2.余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司)

摘要：隨機(jī)選擇5月齡左右獺兔50只。采用直接測(cè)序方法檢測(cè)獺兔成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子5(FGF5)基因第4個(gè)外顯子的基因多態(tài)性；并對(duì)獺兔毛皮性狀的相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較；將獺兔CDS編碼區(qū)序列同其他物種進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所選獺兔群中，未發(fā)現(xiàn)堿基突變位點(diǎn)，在所有的個(gè)體中，僅發(fā)現(xiàn)一種單倍體型；獺兔的主要毛皮性狀差異不顯著(P>0.05)；獺兔CDS序列同其他物種相比差異不大。

關(guān)鍵詞：FGF5基因；多態(tài)性分析；毛皮性狀；獺兔

獺兔，原名力克斯兔(Rex rabbit)，原產(chǎn)于法國(guó)，是珍貴的裘皮用兔，因其皮毛酷似珍貴的毛皮獸—水獺，故稱之為獺兔[1]。獺兔貴在毛皮，廣泛用于服裝業(yè)，制作成裘皮大衣、圍巾等，具有良好的保暖作用，養(yǎng)殖前景十分廣闊[2]。

成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)廣泛存在于各組織中，迄今為止已鑒定出23種FGFs，F(xiàn)GF5是FGF家族中的一員[3]。眾多學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，兔毛生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程與毛囊/毛乳頭有著密切聯(lián)系[4-9]，F(xiàn)GF5是唯一通過(guò)影響毛囊生長(zhǎng)期的長(zhǎng)短從而影響被毛長(zhǎng)度的調(diào)控因子[10]，F(xiàn)GF5基因?qū)ν玫拿ば誀罹哂兄匾恼{(diào)節(jié)作用，可以作為研究其毛皮性狀的遺傳標(biāo)記[11-12]。

本研究通過(guò)PCR方法擴(kuò)增出獺兔FGF5基因的第4個(gè)外顯子后，采用直接測(cè)序方法檢測(cè)并分析FGF5基因外顯子4的多態(tài)性，分析獺兔群體毛皮性狀的相關(guān)數(shù)據(jù)，并將獺兔的CDS序列同其他物種進(jìn)行對(duì)比，以期為研究FGF5基因與獺兔毛皮性狀的相關(guān)性提供理論依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)在余姚市欣農(nóng)兔業(yè)有限公司兔場(chǎng)進(jìn)行，隨機(jī)選擇5月齡左右獺兔50只。屠宰測(cè)定毛皮性狀前，頸靜脈采血10 mL于抗凝管中備用；測(cè)定毛長(zhǎng)及皮板長(zhǎng)、皮板寬等主要毛皮性狀。

1.2基因組DNA提取采用血液基因組DNA提取試劑盒提取獺兔血液基因組DNA，使用微量核酸儀檢測(cè)所提取的DNA濃度，保證所提取的DNA濃度在80 ng/μL以上。

1.3引物設(shè)計(jì)使用Primer 5.0設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出兔FGF5基因外顯子4的片段，片段長(zhǎng)度為300 bp左右。引物由上海某生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見(jiàn)表1。

表1　PCR擴(kuò)增所用引物序列、產(chǎn)物長(zhǎng)度

1.4PCR擴(kuò)增PCR擴(kuò)增總體積為50 μL，其中包括25 μL Premix TaqTM、21 μL ddH20、上下游引物各1 μL (10 pmol/gL)、2 μL模板DNA。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；然后94℃ 45 s，復(fù)性溫度54℃，72℃ 1 min，34個(gè)循環(huán)；72℃繼續(xù)延伸10 min。PCR產(chǎn)物采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)束后采用UVP熒光成像系統(tǒng)分析檢測(cè)擴(kuò)增結(jié)果。

1.5產(chǎn)物純化與測(cè)序未經(jīng)純化的PCR產(chǎn)物送上海某生物技術(shù)有限公司純化并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果使用Clustal x排定DNA序列，再經(jīng)人工核對(duì)，并采用Bioedit，DNA man，DNA star等軟件進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)分析及序列峰圖校正等。

1.6獺兔毛皮性狀的統(tǒng)計(jì)分析供試獺兔按體重大小分為4組，利用Excel記錄整理所得毛皮性狀的相關(guān)數(shù)據(jù)(體重、毛纖維長(zhǎng)、皮板長(zhǎng)、皮板寬等)。采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行單因子組內(nèi)重復(fù)數(shù)等方差分析，對(duì)差異顯著數(shù)據(jù)的組間采用LSD多重方法進(jìn)行比較顯著性分析。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2結(jié)果與分析

2.1FGF5-4基因擴(kuò)增以獺兔基因組DNA為模板，通過(guò)自行設(shè)計(jì)的引物，在PCR反應(yīng)條件下，特異地?cái)U(kuò)增出FGF5第4個(gè)外顯子基因，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，擴(kuò)增條帶長(zhǎng)度在300 bp左右。

2.2FGF5-4基因片段序列及峰圖分析PCR產(chǎn)物直接測(cè)序得到300 bp左右的FGF5-4片段。測(cè)序結(jié)果使用Bioedit軟件的Clustal x功能進(jìn)行排定DNA序列，再經(jīng)人工核對(duì)。測(cè)序所得序列，如圖2所示；測(cè)序所得峰圖，如圖3所示。

圖1　PCR產(chǎn)物電泳圖譜

圖2　FGF5-4基因序列

由圖2序列及圖3峰圖所示，在FGF5-4基因測(cè)序所得的有效序列當(dāng)中，僅有一個(gè)單倍體型，且未見(jiàn)變異位點(diǎn)；FGF5-4基因片段的序列均無(wú)堿基插入和缺失。從以上序列及峰圖可以看出，在FGF5-4基因片段上，所測(cè)獺兔群的分化程度很低。

2.3毛皮性狀的相關(guān)分析詳見(jiàn)表2。

表2　獺兔毛皮性狀方差分析表

注：同列數(shù)據(jù)不同大寫(xiě)字母肩標(biāo)表示差異顯著(P<0.05)；肩標(biāo)相同字母或無(wú)字母標(biāo)注表示差異不顯著(P>0.05)。

由表2可見(jiàn)，經(jīng)方差分析和多重比較，不同組間獺兔的毛纖維長(zhǎng)，差異不顯著(P>0.05)；皮板長(zhǎng)度僅第1組(體重3.696～3.386 kg)顯著高于(P<0.05)第4組(2.765～2.456 kg)，與其他2組相比，則差異不顯著(P>0.05)；皮板寬和皮板面積則第1組(體重3.696～3.386 kg)和第2組(體重3.385～3.076 kg)明顯高于第3組(體重3.075～2.766 kg)和第4組(體重2.765～2.456 kg)，差異顯著(P<0.05)。

2.4FGF5基因CDS序列與其他物種CDS序列比較詳見(jiàn)圖4。

圖3　FGF5-4基因測(cè)序峰圖

圖4　獺兔與其他物種FGF5氨基酸序列對(duì)比結(jié)果(前80位)

通過(guò)NCBI的GenBank中查找兔、狗、家貓、馬、綿羊、牛、山羊、雙峰駝、水牛、豬等物種CDS編碼區(qū)序列所編碼的氨基酸序列，分析對(duì)比不同物種的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，兔、狗、家貓、馬、綿羊、牛、山羊、雙峰駝、水牛、豬等物種CDS編碼區(qū)序列所編碼的氨基酸長(zhǎng)度大都在270個(gè)左右，且不同物種氨基酸序列的差異主要集中在第10～80個(gè)氨基酸。在其他位點(diǎn)的對(duì)比中，不同物種間的氨基酸序列差異較小。經(jīng)過(guò)相關(guān)軟件分析，獺兔同其他物種間CDS編碼區(qū)所編碼的氨基酸相似程度超過(guò)88%。由此可見(jiàn)，F(xiàn)GF5基因在不同物種間的變異程度不大。

3小結(jié)與討論

由圖2基因序列及圖3測(cè)序峰圖可見(jiàn)，在FGF5-4基因測(cè)序所得的有效序列中，僅有一個(gè)單倍體型，且未見(jiàn)變異位點(diǎn)；FGF5-4基因片段的序列均無(wú)堿基插入和缺失。分析序列及峰圖可以看出，在FGF5-4基因片段上，所測(cè)獺兔群的分化程度很低，說(shuō)明FGF5-4基因在所測(cè)獺兔群中相對(duì)保守。

結(jié)合研究分析獺兔毛皮性狀的相關(guān)數(shù)據(jù)，可以看出在選擇的獺兔群中，按照體重不同分成的4組中，毛長(zhǎng)組間差異不顯著(P>0.05)；皮板長(zhǎng)僅第1組同第4組差異顯著(P<0.05)，皮板寬則第1組和第2組顯著高于第3組和第4組(P<0.05)。綜上所述，在所選獺兔群體中，其毛皮性狀的差異性不顯著，毛皮性狀的分化程度不大，從而佐證了該群體FGF5-4基因片段的保守性。

根據(jù)獺兔FGF5基因CDS序列與其他物種CDS序列的比較，可以看出FGF5基因在物種間的差異性較小，表明在物種進(jìn)化過(guò)程中FGF5基因相對(duì)保守。

據(jù)相關(guān)學(xué)者對(duì)FGF5基因的研究發(fā)現(xiàn)，有關(guān)獺兔FGF5基因保守性的報(bào)道較少。據(jù)李春笑等(2007)[13]研究表明，加利福尼亞兔的FGF5基因外顯子1和外顯子3存在SNP多態(tài)性，且發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)與加利福尼亞兔的毛皮性狀有極顯著的相關(guān)性；馮凱等(2012)[14]和夏圣榮等(2010)[15]研究了5個(gè)家兔FGF5基因的遺傳多態(tài)性，在FGF5-1A中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)等位基因，3種基因型，在FGF5-3B中發(fā)現(xiàn)了2個(gè)等位基因，2種基因型。高愛(ài)琴等(2006)[16]對(duì)不同綿羊和山羊品種的FGF5基因外顯子1和3的多態(tài)性進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)綿羊和山羊 FGF5 基因外顯子1均存在2處單堿基變異，而外顯子3并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)多態(tài)。在本研究中，筆者所選的是FGF5的第4個(gè)外顯子，且在所測(cè)獺兔群的序列中尚未發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)，說(shuō)明FGF5-4基因片段未見(jiàn)多態(tài)性。

參考文獻(xiàn)

[1]姜允奎. 我國(guó)獺兔業(yè)現(xiàn)狀及走勢(shì)分析[J]. 農(nóng)村養(yǎng)殖技術(shù),2007,22:4-7.

[2]沈培軍. 我國(guó)獺兔業(yè)的現(xiàn)狀及開(kāi)發(fā)對(duì)策[J]. 科學(xué)種養(yǎng),2006,10:6-7.

[3]王丙萍. 靶除FGF5基因體細(xì)胞克隆絨山羊的研究[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2014.

[4]高愛(ài)琴，李金泉，李寧，等. 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-5在安哥拉兔皮膚毛囊的作用研究進(jìn)展 [J]. 畜牧與飼料科學(xué)，2005(3)：30-31.

[5]Rosenquist T A,Martin G R. Fibroblast growth factor signalling in the hair growth cycle: expression of the fibroblast growth factor receptor and ligand genes in the murine hair follicle[J]. DevDyn,1996,205(4):379-386.

[6]Konyukhov B V,Martynova M Yu, Nesterova A P. Gene angora as a modifier of the hairless gene in mouse [J]. Russ J Genet,2007, 43(2):190-195.

[7]高愛(ài)琴，李寧，李金泉，等. 山羊FGF5基因cDNA分子克隆及序列分析[J].內(nèi)蒙古大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，37(2 )：180-184.

[8]高愛(ài)琴，李金泉，李寧，等. 綿羊FGF5基因 SNP 的生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)畜牧雜志， 2008，44(5)：5-7.

[9]Paus R, Cotsarelis G. The biology of hair follicles[J]. N Engl J Med,1999,341(7):491-497.

[10]高愛(ài)琴，李 寧，李金泉，等.不同發(fā)育階段絨山羊皮膚中FGF5基因mRNA表達(dá)的 RT-PCR 檢測(cè)[J].華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2008, 23(1): 36-37.

[11]宦霞娟. 獺兔KAP和FGF5基因多態(tài)性與其經(jīng)濟(jì)性狀的關(guān)系研究[D].西北農(nóng)林科技大學(xué),2009.

[12]Petho-Schramm A,Muller H J,Paus R.FGF5 and the murine haircycle [J].Arch Dermatol Res,1996,288(5-6): 264-266.

[13]李春笑. 家兔FGF5基因外顯子Ⅰ和Ⅲ多態(tài)性研究及其與生產(chǎn)性能相關(guān)分析[D].四川農(nóng)業(yè)大學(xué),2007.

[14]馮凱,吳添文,張蕾,何孟頡,高波,吳信生. 5個(gè)家兔群體FGF5基因的遺傳多樣性分析[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué),2012,03:5-8.

[15]夏圣榮,馮凱,吳添文,朱程程,吳信生. 5個(gè)家兔群體FGF5基因部分外顯子1的遺傳多樣性分析[J]. 草食家畜,2010,04:22-25.

[16]高愛(ài)琴，李 寧，趙興波，等. 山羊FGF5基因單核苷酸多態(tài)性群體遺傳學(xué)分析[J]. 華北農(nóng)學(xué)報(bào)，2006,21(3): 71-76.

中圖分類(lèi)號(hào)：S829.12

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1005-7307(2016)02-0004-004

作者簡(jiǎn)介：劉健(1990-)，男，山東省濰坊市人，碩士研究生，主要研究方向?yàn)閯?dòng)物遺傳育種與繁殖。E-mail：liujian1990@zju.edu.cn.*通訊作者：張金枝(1966-)，E-mail: zhangjzs@zju.edu.cn

基金項(xiàng)目：寧波市科技局農(nóng)村科技創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)資助項(xiàng)目(201201C8000037).

收稿日期：2016-01-26