冀錦華，王小兵，孟建宇，繆 愷

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院應(yīng)用與環(huán)境微生物研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院作物育種與栽培研究所，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031；3.錫林郭勒盟創(chuàng)綠環(huán)境監(jiān)理公司，內(nèi)蒙古錫林浩特 026000）

森林土壤是指在木本植被下發(fā)育的各類土壤的總稱，主要用于供給森林植物生活物質(zhì)。森林土壤微生物是完成森林生態(tài)系統(tǒng)中物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化兩大功能的主要力量。而森林土壤真菌作為森林土壤生態(tài)系統(tǒng)中一類非常重要的微生物群落，對(duì)森林中植物的生長(zhǎng)、物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。土壤真菌多樣性一般包括遺傳多樣性、物種多樣性和生態(tài)系統(tǒng)多樣性3個(gè)方面，而物種多樣性是多樣性研究中最基本的內(nèi)容，主要是指區(qū)域內(nèi)真菌物種組成的豐富度和分布的均勻度[1]。

土壤真菌多樣性研究的方法主要有傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)方法和分子生物學(xué)研究方法，傳統(tǒng)的分離方法主要有稀釋平板法和土壤平板法等[2-3]。但傳統(tǒng)的純培養(yǎng)方法測(cè)得的微生物只占微生物總數(shù)的1%左右[4]，不能反映土壤中微生物分布的真實(shí)情況。Biolog鑒定和生物標(biāo)記法以及變性梯度凝膠電泳（Denaturing Gradient Gel Electrophoresis，DGGE）、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性技術(shù)（RFLP）、熒光原位雜交技術(shù)（FISH）等分子生物學(xué)技術(shù)雖然較傳統(tǒng)方法有很大的進(jìn)步，但其存在通量低，信息量小等缺點(diǎn)[5]，不能更細(xì)致更詳細(xì)地對(duì)土壤微生物進(jìn)行分析研究。與此同時(shí)，新一代高通量測(cè)序技術(shù)（next-generation sequencing technology，或被稱為第二代測(cè)序技術(shù)）出現(xiàn)，數(shù)據(jù)產(chǎn)出通量高，準(zhǔn)確率高，成本低。2007年焦磷酸高通量測(cè)序技術(shù)首次應(yīng)用于土壤微生物16S rRNA基因遺傳多樣性研究[6]。Bates和Lienhard利用高通量測(cè)序分別對(duì)美國(guó)西南部生物土壤結(jié)皮和老撾熱帶草地中真菌的多樣性進(jìn)行了研究[7-8]。此外，Buee[9]、McGuire[10]和 Shi Ling-Ling[11]分別對(duì)不同類型森林中真菌多樣性進(jìn)行了研究。然而，目前尚缺乏應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)大興安嶺森林土壤真菌多樣性的分析。

本試驗(yàn)運(yùn)用Miseq二代高通量測(cè)序平臺(tái)對(duì)內(nèi)蒙古大興安嶺興安落葉松森林的表層土壤進(jìn)行測(cè)序，對(duì)其微生物組成、豐度和多樣性進(jìn)行分析，揭示大興安嶺森林土壤中真菌多樣性，為闡明森林土壤微生物群落與森林生態(tài)系統(tǒng)之間的關(guān)系積累依據(jù)。

1 研究區(qū)域概況

大興安嶺位于黑龍江省、內(nèi)蒙古自治區(qū)東北部，是內(nèi)蒙古高原和松遼平原的分水嶺。平均海拔573 m，晝夜溫差大，年平均氣溫-2.8℃，最低氣溫-54℃，年平均降水量746mm，氣候?qū)俸疁貛駶?rùn)季風(fēng)氣候，其原始森林茂密，是中國(guó)重要的林業(yè)基地之一。采樣地點(diǎn)位于內(nèi)蒙古大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)定位站附近，地處大興安嶺西北坡，為中山山地，林地土壤以棕色針葉林土為主，土壤厚度0～10 cm（表面枯枝落葉除外），興安落葉松是其主要樹(shù)種，種植面積占總面積的79%。

2 材料和方法

2.1 樣品采集

本試驗(yàn)土壤樣品采自于內(nèi)蒙古大興安嶺森林生態(tài)系統(tǒng)定位站（N 50°49′～50°51′，E 121°30′～121°31′）附近的原始興安落葉松林區(qū)，采樣時(shí)間為2014年9月。在相同樹(shù)種的3個(gè)不同地點(diǎn)（海拔為784～142 m）進(jìn)行采樣。采集過(guò)程中先去除土壤表面的枯枝落葉，用經(jīng)滅菌的采樣鏟采集暗棕壤表面0～10 cm深的土壤樣品，部分樣品迅速放入已滅菌的50 mL離心管，密封包裝后放于冰盒中，運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后存于-80℃低溫冰箱中，進(jìn)行樣品總DNA提取等試驗(yàn)；將3個(gè)剩余的樣品混合均勻，盡快進(jìn)行理化指標(biāo)的測(cè)定，每項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定3個(gè)重復(fù)。

2.2 理化性質(zhì)的測(cè)定

土壤樣品的有機(jī)質(zhì)含量測(cè)定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1121.6-2006，速效氮含量測(cè)定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)DB13/T843-2007，速效磷含量測(cè)定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)LY/T1233-1999，pH值測(cè)定依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)NY/T1121.2-2006，含水量用烘干法測(cè)定。

2.3 樣品基因組總DNA提取

用E.Z.N.A Soil DNA Kit（OMEGA，USA）對(duì)土樣的基因組DNA按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行提取，得到的基因組DNA 用 TE 溶液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH值8.0）溶解，儲(chǔ)存于-20℃用于后續(xù)研究。

2.4 ITS區(qū)高通量測(cè)序

先利用瓊脂糖電泳對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行完整性和濃度檢測(cè)，再用Qubit2.0 DNA試劑盒對(duì)基因組DNA精確定量并確定PCR反應(yīng)中加入DNA的量。用融合了Miseq測(cè)序平臺(tái)通用引物的引物進(jìn)行 PCR，對(duì)產(chǎn)物的 ITS區(qū)（Internal Transcribed Spacers）進(jìn)行瓊脂糖電泳、回收和定量，根據(jù)測(cè)得的DNA濃度把所有樣品按1∶1比例混合，充分振蕩均勻，對(duì)混合樣品進(jìn)行建庫(kù)，利用Miseq測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序。

2.5 序列處理

在測(cè)序試驗(yàn)中，樣品的序列引入了標(biāo)示樣本來(lái)源信息的barcode標(biāo)簽序列[12]更高質(zhì)量、更精準(zhǔn)的生物信息學(xué)分析，再對(duì)有效序列進(jìn)行質(zhì)量控制（QC），最后去除非靶區(qū)域序列和嵌合體。

2.6 多樣性指數(shù)分析（Alpha-diversity）

得到優(yōu)化序列后，為了解樣品測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息，把序列按相似性（0.97）進(jìn)行操作分類單元（OTU，Operational Taxonomic Units）聚類分析，從每個(gè)分好的OTU中選一條代表序列（豐度最高），用RDP classifier（分類閾值為0.8）進(jìn)行不同物種水平［kingdom（界），phylum（門(mén)），class（綱），order（目），family（科），genus（屬）］的物種分類。

通過(guò)單樣本的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性。計(jì)算菌群豐度（Community richness） 的指數(shù)有 Chao、Ace；計(jì)算菌群多樣性（Community diversity）的指數(shù)有 Shannon、Simpson；測(cè)序深度指數(shù)有Coverage。從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，統(tǒng)計(jì)這些個(gè)體所代表的物種數(shù)目，并以個(gè)體數(shù)與物種數(shù)來(lái)構(gòu)建稀釋性曲線；利用樣本在不同測(cè)序深度時(shí)的測(cè)序量來(lái)構(gòu)建Shannon-Wiener曲線。

2.7 群落結(jié)構(gòu)

由分類學(xué)分析結(jié)果可得知樣本在各分類學(xué)水平下的群落結(jié)構(gòu)組成，包括樣本中含有的微生物種類和各類微生物的序列數(shù)及比例，即微生物的相對(duì)豐度。將群落結(jié)構(gòu)分析用餅狀圖或柱狀圖等形式呈現(xiàn)出來(lái)，可在每個(gè)分類學(xué)水平進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)的分析。

3 結(jié)果與分析

3.1 土壤理化性質(zhì)

對(duì)3個(gè)不同地點(diǎn)的混合土樣的理化性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定。大興安嶺興安落葉松森林表層土壤pH值為5.4左右，為酸性土壤，含水量為37.8%，有機(jī)質(zhì)含量為114.08 g/kg，速效氮含量為554 mg/kg，速效磷含量為0.105 mg/kg。

3.2 多樣性及群落結(jié)構(gòu)分析

3.2.1 測(cè)序序列處理 經(jīng)Miseq測(cè)序平臺(tái)測(cè)序得到30 000多條原始序列，長(zhǎng)度在60 bp左右，3 000多條序列長(zhǎng)度在280 bp左右。經(jīng)質(zhì)控后的序列條數(shù)為4 411，大部分在 200～270 bp，其中，非目標(biāo)區(qū)域擴(kuò)增序列數(shù)為1 145，嵌合體數(shù)目為6條，最終可用于分析的序列數(shù)目為3 260。

3.2.2 多樣性指數(shù)分析 樣品經(jīng)Miseq高通量測(cè)序得到的序列共分為51個(gè)OTU，Alpha多樣性指數(shù)Shannon為 0.818 9，覆蓋度（Coverage）為 0.855 9。樣品測(cè)序覆蓋度為85.6%，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可以較好地反映土壤中微生物真實(shí)的群落結(jié)構(gòu)。指數(shù)Chao和Ace估算的OTU數(shù)目分別為85和155，與實(shí)際聚類分析得到的OTU數(shù)目相差不大，可以大致反映土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)。

Shannon-Wiener曲線可反映樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。樣品的Shannon-Wiener曲線見(jiàn)圖1，從圖1中可以看出，樣本的Shannon-Wiener曲線趨于平坦，可以大致反映樣本中真菌菌群的多樣性。

稀釋性曲線用于比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度，也可以用來(lái)說(shuō)明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。樣品的稀釋性曲線如圖2，可以看出樣品的稀釋性曲線沒(méi)有進(jìn)入平坦的趨勢(shì)，還在繼續(xù)上升，說(shuō)明測(cè)序深度不夠，若增加測(cè)序深度會(huì)產(chǎn)生更多新的OTU。

3.2.3 群落結(jié)構(gòu)分析 使用統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析方法，對(duì)樣本在不同分類水平上的真菌群落結(jié)構(gòu)組成進(jìn)行分析。樣品測(cè)出的序列中未分類的類群和未分類的真菌只占很小部分，真菌群落結(jié)構(gòu)在門(mén)水平（圖3）上主要?jiǎng)澐譃?個(gè)門(mén)，分別有Basidiomycota（擔(dān)子菌門(mén)）（0～97.91%）、Ascomycota（子囊菌門(mén)）（0～0.95%）、Zygomycota（接合菌門(mén)）（0～0.06%）及一小部分未分類類群（0.52%）和未分類的真菌菌群（0.55%）。

在綱水平（圖4）上，Agaricomycetes（傘菌綱）占真菌群落的絕大多數(shù)，unclassified Fungi（未分類的真菌）、Eurotiomycetes（散囊菌綱）和 unclassified（未分類類群）的比例近乎相等，而且比例都較小，其他群落還有Sordariomycetes（糞殼菌綱）、unclassified Ascomycota（未分類的子囊菌綱）、Dothideomycetes（座囊菌綱）、Zygomycota class Incertae sedis（未確定分類地位的接合菌綱）、Ascomycota class Incertae sedis（未確定分類地位的子囊菌綱）、Saccharomycetes（酵母綱）、unclassified Basidiomycota（未分類的擔(dān)子菌綱）、Leotiomycetes（錘舌菌綱），比例只占整個(gè)真菌群落的0.03%～0.12%，分布差異非常小。

樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的組成見(jiàn)圖5，類群unclassified Cantharellales未分類的雞油菌目（97.52%）占絕大多數(shù)，unclassified Fungi未分類的真菌（0.55%）和unclassified未分類類群（0.52%）只占真菌菌群的一小部分，二者比例相近，剩余的真菌群落有 Cladophialophora屬 （0.21%）、unclassified Thelephoraceae未分類的革菌科（0.18%）、unclassified Herpotrichiellaceae類群 （0.15%）、Minimedusa屬（0.12%）、unclassified Ascomycota未分類的子囊菌門(mén) （0.12%）、Exophiala 外瓶霉屬 （0.06%）、Chaetosphaeria屬（0.06%）、Podospora柄孢殼菌屬（0.06%）、Capronia屬（0.06%）、Scolecobasidium 齒梗孢屬（0.03%）、Scheffersomyces屬（0.03%）、Russula紅菇屬（0.03%）、unclassified Hysteriales未分類的縱裂菌目（0.03%）、Penicillium青霉菌屬（0.03%）、Mycena小菇屬（0.03%）、Mollisia軟盤(pán)菌屬（0.03%）、Umbelopsis傘狀霉屬（0.03%）和其他類群。樣品中真菌群落在屬水平上，除類群unclassified Cantharellales外其余類群所占比均很小，且差異不大。

4 討論

高通量測(cè)序方法廣泛應(yīng)用于微生物多樣性的分析，但一般用于少數(shù)不需要描述微生物時(shí)空多樣性的樣品的分析[13]。Buee等[9]運(yùn)用454高通量測(cè)序法研究了森林土壤真菌結(jié)構(gòu)多樣性，結(jié)果表明：土壤真菌的數(shù)量和多樣性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于先前的假設(shè)，其中少數(shù)真菌種類占據(jù)了土壤真菌數(shù)量的大部分。高通量焦磷酸測(cè)序的引入增加了微生物群落分析的準(zhǔn)確度，但其主要的缺點(diǎn)是片段限制性[14]。與早期的高通量測(cè)序方法相比，新的高通量測(cè)序方法具有較高的靈敏度和產(chǎn)出通量，讀長(zhǎng)長(zhǎng)，可以進(jìn)行微生物群落成員的鑒定和相對(duì)定量，在土壤微生物多樣性研究中可以獲得更加豐富的信息。

O'Brien等[15]用ITS克隆文庫(kù)從森林土壤中得到412個(gè)種系，森林土壤ITS克隆文庫(kù)中的Ascomycota（子囊菌門(mén)）和Basidiomycota（擔(dān)子菌門(mén)）序列比例（46%和41%）相差不大，而Zygomycota和Glomerom ycota占ITS克隆文庫(kù)序列的1.5%和0.5%。但本研究中Basidiomycota（擔(dān)子菌門(mén)）序列占大多數(shù)，與Ascomycota和Basidiomycota序列數(shù)目相比，Zygomycota的序列比例非常小，只占所有序列的0.06%。這與O'Brien的研究結(jié)果相差很大，但真菌菌群類型與Scott T.Bates對(duì)美國(guó)西南部生物土壤結(jié)皮中真菌類型的研究結(jié)果[7]一致，而且，Basidiomy cota和Ascomycota屬于腐生營(yíng)養(yǎng)土壤真菌[16]，在土壤真菌群落中占主導(dǎo)地位。

真菌在土壤中有特殊地位，其喜酸性使他們?cè)谒嵝陨滞寥乐杏葹橹匾?。興安落葉松林土壤微生物在種類上，經(jīng)傳統(tǒng)培養(yǎng)方法，李曉彤等[17]分離鑒定到真菌18屬，其中，以青霉屬（Penicillium）、曲霉屬（Aspergillus）、毛霉屬（Mucor）和木霉屬（Trichoderma）為優(yōu)勢(shì)屬。而本試驗(yàn)從興安落葉松林土樣中得到21個(gè)屬，其中，類群unclassified Cantharellales未分類的雞油菌目（97.52%）占絕大多數(shù)，unclassified Fungi未分類的真菌（0.55%）和unclassified未分類類群（0.52%）只占真菌菌群的一小部分，二者比例相近。說(shuō)明高通量測(cè)序得到的菌群多數(shù)為不可培養(yǎng)微生物。

Rousk J等[18]對(duì)耕地土壤中真菌群落研究發(fā)現(xiàn)，土壤中真菌的相對(duì)豐度不受pH值影響，pH值與真菌多樣性相關(guān)性較小。土壤微生物群落受土壤質(zhì)地、礦物質(zhì)和植物殘?bào)w的質(zhì)量等多種因素的影響[17]。Scott T.Bates等[7]通過(guò)對(duì)美國(guó)西南部生物土壤結(jié)皮中真菌多樣性模式研究發(fā)現(xiàn)，擔(dān)子菌門(mén)的傘菌綱和銀耳綱占生物土壤結(jié)皮中真菌群落的7%和1%；子囊菌門(mén)的座囊菌綱、散囊菌綱、茶漬綱、錘舌菌綱、李基那地衣綱、盤(pán)菌綱和糞殼菌綱分別占42%、6%、1%、4%、6%、10%和13%；接合菌門(mén)的接合菌綱占5%，其余不確定分類的菌群占5%；Lienhard等[8]對(duì)老撾熱帶草地中真菌群落研究發(fā)現(xiàn)，草地中真菌群落在門(mén)水平有Ascomycota（子囊菌門(mén)）、Basidiomycota（擔(dān)子菌門(mén)）、Chytridiomycota（壺菌門(mén)）、其他類群、未分類類群和未知類群，同樣，子囊菌門(mén)在真菌群落中比例較擔(dān)子菌門(mén)高。前者研究的擔(dān)子菌門(mén)的銀耳綱和子囊菌門(mén)的茶漬綱、李基那地衣綱和盤(pán)菌綱以及后者中的壺菌門(mén)在本次測(cè)序結(jié)果中沒(méi)有出現(xiàn)，而且本次結(jié)果中擔(dān)子菌門(mén)的比例比子囊菌門(mén)高出很多，與二者結(jié)果不同。但其他關(guān)于森林土壤中真菌群落的研究[14]發(fā)現(xiàn)，擔(dān)子菌門(mén)在真菌群落中的比例較子囊菌門(mén)高，這可能與土壤質(zhì)地和植被類型有很大關(guān)系。

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