牛文斌　孔祥波　馬永亮　程　亮　張東升

(佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，黑龍江　佳木斯　154002)

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AQP1基因沉默對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的影響

牛文斌孔祥波1馬永亮程亮張東升

(佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科，黑龍江佳木斯154002)

〔摘要〕目的探討水通道蛋白1(AQP1)基因沉默對(duì)在前列腺癌PC-3細(xì)胞的作用。方法培養(yǎng)PC-3細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，隨機(jī)分為質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組和質(zhì)?？瞻捉M。針對(duì)AQP1基因設(shè)計(jì)合成小片段RNA，并構(gòu)建高效表達(dá)載體。利用轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine(TM)2000用脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)染技術(shù)將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PC-3細(xì)胞。RT-PCR 檢測(cè)PC-3細(xì)胞AQP1 mRNA的表達(dá)情況及激光共聚焦觀察室觀察、拍照AQP1表達(dá)的情況，轉(zhuǎn)染后72 h。將鼠齡為6 w的60只BALB/c(nu-/nu-)雄裸鼠隨機(jī)分成兩組，其中對(duì)照組30只，轉(zhuǎn)染組30只。轉(zhuǎn)染組把轉(zhuǎn)染后的前列腺癌PC-3細(xì)胞注射裸鼠腋窩處皮下(對(duì)照組把未經(jīng)轉(zhuǎn)染的前列腺癌PC-3細(xì)胞注射到裸鼠腋窩處皮下)。每日觀察腫瘤生長(zhǎng)及體重情況，裸鼠飼養(yǎng)6 w處死，完整取出移植瘤瘤體測(cè)量體積和重量。結(jié)果與質(zhì)?？瞻捉M相比，轉(zhuǎn)染組應(yīng)用RNA干擾技術(shù)后AQP-1在前列腺癌PC-3細(xì)胞系中mRNA的水平降低，與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤體積為(573.39±175.24)mm3 明顯小于對(duì)照組(1 482.50±327.86)mm3(P=0.03)。轉(zhuǎn)染組腫瘤重量為(0.55±0.11)g明顯小于對(duì)照組〔(1.31±0.29)g，P= 0.027〕。結(jié)論AQP-1廣泛的表達(dá)在正常前列腺組織和前列腺癌組織中，對(duì)內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)起著重要的作用。更多的AQP-1促進(jìn)了前列腺癌細(xì)胞的增長(zhǎng)，抑制AQP-1的表達(dá)可以使前列腺癌移植瘤生長(zhǎng)減慢，體積減小。

〔關(guān)鍵詞〕水通道蛋白1(AQP1);前列腺癌

前列腺癌有明顯的地區(qū)差異和種族差異〔1〕。在我國(guó)，近年因?yàn)槔淆g人口增多，同時(shí)各種先進(jìn)儀器設(shè)備的大量出現(xiàn)及診斷前列腺癌的方法不斷改進(jìn)，前列腺癌的發(fā)病率不斷增高〔2〕。水通道蛋白(AQP)-1高度表達(dá)于許多腫瘤細(xì)胞和腫瘤組織血管內(nèi)皮細(xì)胞，增加腫瘤上皮和血管對(duì)水的通透性運(yùn)輸，促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)及向周?chē)|(zhì)浸潤(rùn)〔3〕。以往研究表明AQP1在前列腺癌組織中高表達(dá)〔4〕，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用RNA干擾(RNAi)技術(shù)和裸鼠前列腺癌移植瘤模型，探討AQP1的高表達(dá)對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞和移植瘤組織的影響。

1材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料人前列腺癌PC-3細(xì)胞株(ATCC細(xì)胞系)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，所郵寄的細(xì)胞為活細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)所用裸鼠品系為60只6周齡體重均勻的BALB/c(nu-/nu-)裸鼠，購(gòu)買(mǎi)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司。動(dòng)物飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的小鼠飼養(yǎng)隔離器內(nèi)。

1.2前列腺癌PC-3細(xì)胞AQP1免疫組化檢測(cè)人前列腺癌PC-3細(xì)胞按上海中科院細(xì)胞庫(kù)推薦的培養(yǎng)條件，使用含10%胎牛血清的F12培養(yǎng)液，置于37℃，5%二氧化碳(CO2)細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每日在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況和細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)等。待細(xì)胞融合度約70%時(shí)，吸出培養(yǎng)液。加入0.01 mol/L磷酸緩沖液(PBS)2 ml，作用5 min后吸出棄掉，重復(fù)洗片3次。之后加4%多聚甲醛1 ml固定30 min。再次用PBS洗3次，每次5 min。棄掉PBS后加入1%BSA封閉液進(jìn)行封閉，室溫下作用30 min后棄掉BSA封閉液，不用PBS清洗。每塊六孔板中的3個(gè)孔加入200 μl一抗(兔多克隆抗AQP1一抗，1∶100倍稀釋)，另外3個(gè)孔對(duì)照組加等量抗體稀釋液，不加兔多克隆抗AQP1一抗。做好標(biāo)記，4℃過(guò)夜(或37℃孵育2 h)。加一抗后的細(xì)胞及對(duì)照組細(xì)胞4℃過(guò)夜(或37℃孵育2 h)后在室溫放置2 h，0.01 mol/L PBS洗片3次，每次5 min，避光條件下加入熒光(FITC)標(biāo)記羊抗兔IgG(熒光二抗,1∶50倍稀釋)，室溫放置2 h后用0.01 mol/L PBS洗片(避光條件下)3次，每次5 min。做好以上步驟后，將板子里放點(diǎn)PBS，保存片子濕潤(rùn)，不要干片，以免影響細(xì)胞形態(tài)。到激光共聚焦觀察室后，再將爬片取出，在干凈的載玻片上滴1滴50%的甘油，然后將爬片取出來(lái)倒扣在滴過(guò)甘油的載玻片上，顯微鏡下觀察、拍照。

1.3RT-PCR 檢測(cè) AQP1 mRNA的表達(dá)從前列腺癌PC3細(xì)胞系中提取總RNA,紫外分光光度計(jì)測(cè)定總 RNA純度并計(jì)算其濃度。應(yīng)用RT試劑盒逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 。根據(jù)AQP1在GenBank中的cDNA全長(zhǎng)序列，使用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物，引物由上海生工生物工程公司合成。進(jìn)入半定量PCR反應(yīng)體系,AQP1引物序列：上游:5′-GAAATCCCAACTCCAAAGAG-3′ ;下游:5′-CAGCTAGACAATGATTTGGC-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度為251 bp;人β-actin引物:上游:5′-AGCGCAAGTA CTCCGTGTG-3′ ;下游:5′-AAGCAATGCTATCACCTCCC-3′,擴(kuò)增長(zhǎng)度501 bp;PCR反應(yīng)條件:95℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 40 s,擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。上下游引物分別用適量滅菌雙蒸水溶解至濃度為10 pmol/μl。 PCR反應(yīng)體系為cDNA模板1 μl、AQP1上下游引物各0.5 μl、人β-actin上下游引物各0.2 μl。 PCR 產(chǎn)物在 2%瓊脂糖凝膠上電泳分析。

1.4siRNA載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)染構(gòu)建的重組質(zhì)粒經(jīng)DNA測(cè)序技術(shù)證實(shí)重組質(zhì)粒序列與所設(shè)計(jì)序列完全一致，表明針對(duì)AQP1基因的siRNA表達(dá)載體構(gòu)建成功。構(gòu)建好的CTD468-18超純質(zhì)粒用脂質(zhì)體法成功轉(zhuǎn)染前列腺癌PC-3細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)40%。采用Western印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中AQP1蛋白的表達(dá)，結(jié)果2組細(xì)胞β-actin雜交帶亮度相似，在位于28 kD蛋白條帶位置均呈現(xiàn)AQP1特異性蛋白雜交條帶的表達(dá)，但亮度有明顯差異，其中轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的蛋白條帶亮度明顯低于空白對(duì)照組。

1.5裸鼠的飼養(yǎng)及腫瘤細(xì)胞的種植本實(shí)驗(yàn)所用裸鼠飼養(yǎng)于佳木斯大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心的小鼠飼養(yǎng)隔離器內(nèi),觀察小鼠的生長(zhǎng)狀況。取轉(zhuǎn)染72 h的前列腺癌細(xì)胞及正常培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞，胰酶消化收獲至離心管中，1 000 r/min，5 min，離心后去除培養(yǎng)液，如此反復(fù) PBS 沖洗 3 次，以去除殘留的培養(yǎng)液，以苔盼藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞活率，檢測(cè)存活率90%以上后方可用于接種動(dòng)物。用 PBS 將細(xì)胞調(diào)至密度 4×107/ml，重懸細(xì)胞并混勻，放入無(wú)菌 Eppendorf管，并用封口膠密封，置入冰盒待用。收集好的細(xì)胞最好在 30 min 內(nèi)接種，以保證各組細(xì)胞活力。采用6周齡雄性裸鼠60只，隨機(jī)分為2組，每組30只，分別接種前列腺癌細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后的前列腺癌細(xì)胞，碘伏溶液消毒穿刺點(diǎn)兩次。上下顛倒 Eppendorf 管以混勻細(xì)胞懸液，用注射器吸取細(xì)胞懸液。每只裸鼠皮下注射 200 μl，針頭與皮膚大約 10°~15°方向斜行刺入皮膚約1.0 cm，輕輕挑起皮膚后開(kāi)始注射，以免刺入胸腹腔，注射完畢后，慢慢退出針頭，用無(wú)菌棉簽輕輕按壓穿刺點(diǎn)約 2 min，以防細(xì)胞懸液溢出。用碘伏溶液消毒穿刺點(diǎn)，以防感染。接種后，每天觀察裸鼠，觀察裸鼠及腫瘤生長(zhǎng)情況，42 d后終止觀察處死裸鼠，小心完整剝離出皮下移植瘤。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS13.0軟件行t檢驗(yàn)及方差分析。

2結(jié)果

2.1AQP1在PC-3細(xì)胞的表達(dá)通過(guò)激光共聚焦顯微鏡觀察、拍照分析及Western印跡蛋白檢測(cè)，證實(shí)AQP1在前列腺癌細(xì)胞表達(dá)，且主要表達(dá)于細(xì)胞膜及胞質(zhì)。激光共聚焦顯微鏡顯示細(xì)胞膜及胞質(zhì)被染成綠色，細(xì)胞核未著色(圖1A)。轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡觀察： 熒光顯微鏡下，用紫外光激發(fā)，觀察細(xì)胞。未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞不顯色，轉(zhuǎn)染細(xì)胞呈紅色熒光(圖1B)。

A：AQP1在前列腺癌PC-3 細(xì)胞中表達(dá)；B：熒光顯微鏡下siRNA轉(zhuǎn)染的PC-3細(xì)胞圖1　AQP1在PC-3細(xì)胞中的表達(dá)(×200)

2.2AQP1 mRNA在PC-3細(xì)胞的表達(dá)AQP1的RT-PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后，紫外透射儀下在300 bp左右可見(jiàn)明顯的特異產(chǎn)物帶，表明AQP1正常表達(dá)。同對(duì)照組相比(0.954±0.032)，轉(zhuǎn)染組表達(dá)減弱有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異〔(0.610±0.060)，P<0.05〕。

2.3Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PC-3細(xì)胞中AQP1蛋白的表達(dá)兩組細(xì)胞β-actin雜交帶亮度相似，在位于28 kD蛋白條帶位置均呈現(xiàn)AQP1特異性蛋白雜交條帶的表達(dá)，但亮度有明顯差異，其中轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的蛋白條帶亮度明顯低于對(duì)照組(圖2)。

1Marker:2正常前列腺癌PC-3細(xì)胞;3轉(zhuǎn)染后前列腺癌PC-3細(xì)胞圖2　Western印跡AQP1蛋白在正常前列腺癌PC-3細(xì)胞及轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中的表達(dá)

2.4裸鼠皮下移植腫瘤體積及重量比較兩組裸鼠生命活動(dòng)正常,無(wú)一死亡。與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)染組裸鼠移植瘤體積為(373.39±175.24)mm3明顯小于對(duì)照組(882.50±327.86)mm3(P=0.03)。轉(zhuǎn)染組腫瘤重量為(0.55±0.11)g 明顯小于對(duì)照組〔(1.31±0.29)g，P=0.027〕。

3討論

AQPs是家族性膜通道蛋白，能夠快速的介導(dǎo)水和一些小分子物質(zhì)通過(guò)。AQPs廣泛分布于機(jī)體的組織和器官，不同的組織和器官有不同的AQP分布，有時(shí)是多種AQP分布于同一器官，有利于維護(hù)組織器官的生理功能〔5〕。AQPs除了生理情況下調(diào)節(jié)微環(huán)境維護(hù)器官的生理功能外，病理情況下特別是在腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中起了重要的作用〔6〕， AQPs在前列腺癌中的分布和作用的初步研究表明AQP1在前列腺癌組織中高表達(dá)，抑制AQP1的表達(dá)可以抑制PC-3細(xì)胞的遷移〔7〕。AQP1大量表達(dá)于腫瘤細(xì)胞膜或許能夠改變腫瘤上皮內(nèi)的滲透壓，有助于腫瘤細(xì)胞體積及外形的改變，向周?chē)|(zhì)浸潤(rùn)〔8〕。前期試驗(yàn)表明〔4，9〕AQP1大量表達(dá)于前列腺癌組織中的腫瘤血管內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞的胞質(zhì)內(nèi)及胞膜上，其表達(dá)量較正常前列腺組織明顯增多，但是AQP1在前列腺癌PC-3細(xì)胞中的不同水平表達(dá)及對(duì)前列腺癌PC-3細(xì)胞的影響還不清楚。

在本次實(shí)驗(yàn)中運(yùn)用免疫組化和RT-PCR 在不同水平檢測(cè)了前列腺癌PC-3細(xì)胞中AQP1的表達(dá)，在激光共聚焦顯微鏡下觀察、拍照，可見(jiàn)前列腺癌細(xì)胞薄膜及胞質(zhì)被染成綠色，胞核未著色，證實(shí)AQP1主要表達(dá)于前列腺癌細(xì)胞膜和胞質(zhì)。

RNAi是通過(guò)雙鏈RNA分子介導(dǎo)的序列特異性轉(zhuǎn)錄后使相關(guān)基因表達(dá)減少或不表達(dá)的過(guò)程，能夠使目標(biāo)基因穩(wěn)定沉默但對(duì)于正?；虻谋磉_(dá)卻不造成影響〔10〕。本研究表明RNAi質(zhì)粒載體的導(dǎo)入明顯抑制了前列腺癌PC-3細(xì)胞的AQP1蛋白表達(dá)。AQP1基因沉默組裸鼠的移植瘤生長(zhǎng)速度及體積明顯小于對(duì)照組，表明干擾AQP1的表達(dá)能夠抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展。

綜上，AQP1高表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的發(fā)生發(fā)展，阻斷或者抑制AQP1的表達(dá)能夠抑制移植瘤的發(fā)展，靶向抑制AQP1可能為前列腺癌的基因治療提供依據(jù)。

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〔2014-12-03修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

〔中圖分類號(hào)〕R737.25

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)07-1596-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.026

基金項(xiàng)目：黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題(2009-328)

1吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院泌尿外科

第一作者：牛文斌(1972-)，男，博士，副主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，主要從事泌尿外科腫瘤研究。