楊笑天　張建華　楊笑宇　王柏欣　王顯鋼　孟德欣　李　晶

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江　佳木斯　154002)

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褪黑素對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中糖基化終產(chǎn)物及其受體表達(dá)的影響

楊笑天張建華1楊笑宇2王柏欣1王顯鋼1孟德欣1李晶1

(佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科，黑龍江佳木斯154002)

〔摘要〕目的研究褪黑素(MT)對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中糖基化終產(chǎn)物(AGE)和其受體(RAGE)表達(dá)的影響。方法清潔級雄性Wistar大鼠80只，體重180~200 g，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組。模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組給予高脂高糖飲食配合鏈尿佐菌素腹腔注射誘導(dǎo)糖尿病模型。造模成功后，低劑量(10 mg·kg(-1)體重·d(-1))和高劑量(20 mg·kg(-1)體重·d(-1))MT灌胃16 w。HE染色觀察大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)改變，免疫組化(SABC)法檢測各組大鼠視網(wǎng)膜中AGE和RAGE表達(dá)的變化。結(jié)果16 w后，HE染色觀察，低劑量和高劑量MT組視網(wǎng)膜病理改變程度均較模型對照組輕。與模型對照組比較，免疫組化法檢測低劑量和高劑量MT組AGE和RAGE蛋白陽性表達(dá)量明顯降低(P<0.05)。結(jié)論MT可改善糖尿病大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化，并可下調(diào)AGE和RAGE在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中的表達(dá)。

〔關(guān)鍵詞〕糖尿病視網(wǎng)膜病變；褪黑素；糖基化終產(chǎn)物；糖基化終產(chǎn)物受體

糖尿病視網(wǎng)膜病變(DR)是糖尿病主要的并發(fā)癥之一，隨病情的進(jìn)展，患者出現(xiàn)不可逆的視力下降，甚至失明。DR的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，糖基化終產(chǎn)物(AGE)及其受體(RAGE)在DR發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用〔1~3〕。褪黑素(MT)是松果體分泌的一種重要激素，具有調(diào)節(jié)睡眠、生殖及晝夜節(jié)律等生理功能。研究發(fā)現(xiàn)，MT具有很強(qiáng)的抗氧化活性，并作為高選擇性電子供體，參與體內(nèi)多種生化反應(yīng)〔4〕。本實驗觀察MT對糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中AGE和RAGE表達(dá)的影響及保護(hù)機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料清潔級雄性Wistar大鼠80只，體重180~200 g(長春億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司)；鏈尿佐菌素(STZ，美國Sigma公司)；MT，浙江黃巖延年褪黑素有限公司；RAGE單克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司)；AGE多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；兔超敏二步法免疫組化檢測試劑盒和濃縮型二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)

1.2模型的建立和分組大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1w后，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組，每組20只。模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT在給予高脂高糖飲食4 w后，禁食24 h，按50 mg·kg-1·體重·d-1腹腔注射STZ，正常對照組注射等體積檸檬酸緩沖液。給藥后72 h，以空腹血糖≥16.7 mmol/L為造模成功。造模后，每天10∶00至14∶00灌胃一次，低劑量MT組灌胃劑量為10 mg·kg-1體重·d-1，高劑量MT組灌胃劑量為20 mg·kg-1體重·d-1，正常對照組和模型對照組用等體積生理鹽水灌胃，持續(xù)16 w。

1.3HE染色和免疫組化染色實驗結(jié)束時，無菌手術(shù)取出完整眼球置入4%多聚甲醛溶液中固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm連續(xù)矢狀切片。HE染色觀察視網(wǎng)膜病理改變。超敏二步法檢測AGE(一抗1∶100，4℃過夜)和RAGE(一抗1∶50，4℃過夜)表達(dá)改變。應(yīng)用Image-ProPlus 6.0圖像分析系統(tǒng)計算AGE和RAGE的陽性染色平均灰度值。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行方差分析。

2結(jié)果

2.1各組視網(wǎng)膜HE染色正常對照組視網(wǎng)膜HE染色切片可見，視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)清晰，排列整齊。模型對照組視網(wǎng)膜各層排列紊亂，節(jié)細(xì)胞缺失，神經(jīng)纖維層變薄，顆粒細(xì)胞排列紊亂，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)疏松。低劑量MT組和高劑量MT組視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)較清晰，排列較整齊，節(jié)細(xì)胞缺失少見，顆粒細(xì)胞排列較規(guī)整。見圖1。

圖1　各組視網(wǎng)膜HE染色(×200)

2.2各組視網(wǎng)膜AGE、RAGE含量變化AGE陽性表達(dá)見于視網(wǎng)膜各層內(nèi)，棕黃色陽性表達(dá)物質(zhì)無特殊表達(dá)部位。RAGE陽性表達(dá)主要見于節(jié)細(xì)胞層和神經(jīng)纖維層，棕黃色陽性表達(dá)物質(zhì)多見于細(xì)胞膜。與正常對照組比較，模型對照組、低劑量MT組和高劑量MT組AGE、RAGE表達(dá)含量顯著升高(P<0.05)；與模型對照組比較，低劑量MT組和高劑量AGE、RAGE陽性表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見表1，圖2和圖3。

表1　各組視網(wǎng)膜中AGE和RAGE陽性

與正常對照組比較：1)P<0.05；與模型對照組比較：2)P<0.05

圖2　各組視網(wǎng)膜AGE免疫組化染色(×400)

圖3　各組視網(wǎng)膜RAGE免疫組化染色(×400)

3討論

DR病理表現(xiàn)為視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞功能障礙，甚至凋亡，毛細(xì)血管基底膜增生、微血管閉塞和無灌注微區(qū)出現(xiàn)，動脈瘤生成、眼底出血和滲出，增殖期表現(xiàn)為黃斑水腫和新生血管形成，纖維血管增殖及收縮牽拉，導(dǎo)致視網(wǎng)膜脫離〔5〕。正常人體的各種組織中有少量AGE形成，且其形成水平隨年齡增長可緩慢增加；對于糖尿病患者，在高血糖狀態(tài)下AGE的形成可被加速。氧化應(yīng)激參與AGE的形成，且形成的AGE可使超氧自由基轉(zhuǎn)變成為活性更高的羥自由基，從而使機(jī)體內(nèi)的氧化應(yīng)激進(jìn)一步增強(qiáng)。RAGE是AGE介導(dǎo)其病理損傷反應(yīng)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體。AGE-RAGE相互作用可激活多個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，引起氧化應(yīng)激及相關(guān)細(xì)胞因子的合成，導(dǎo)致氧化損傷和炎癥反應(yīng)，從而促進(jìn)DR發(fā)展〔6，7〕。MT因其具有極強(qiáng)的抗氧化性，可直接清除細(xì)胞內(nèi)氧自由基，可抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而可能進(jìn)一步影響AGE的形成及其與RAGE的聯(lián)合作用。本實驗證實MT對糖尿病大鼠非酶糖基化過程具有抑制作用。

4參考文獻(xiàn)

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2陳百華，姜德詠，唐羅生.糖基化終產(chǎn)物對牛視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的影響〔J〕.中華眼底病雜志，2002;18(2)：143-5.

3Curtis TM，Hamilton R，Yong PH，etal.Müller glial dysfunction during diabetic retinopathy in rats is linked to accumulation of advanced glycation end-products and advanced lipoxidation end-products〔J〕.Diabetologia，2011;54(3)：690-8.

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6Yamagishi S，Amano S，Inagaki Y，etal.Advanced glycation end products-induced apoptosis and over expression of vascular endothelial growth factor in bovine retinal pericytes〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2002;290(3)：973-8.

7Caldwell RB，Bartoli M，Behzadian MA，etal.Vascular endothelial growth factor and diabetic retinopathy:pathophysiological mechanisms and treatment perspectives〔J〕.Diabetes Metab Res Rev，2003;19(6)：442-55.

〔2014-12-19修回〕

(編輯杜娟)

〔中圖分類號〕R589.1

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1580-02；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.019

通訊作者：孟德欣(1973-)，男，醫(yī)學(xué)博士，副教授，主要從事糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制研究。

基金項目：黑龍江省自然科學(xué)基金(D201046)；佳木斯大學(xué)人才培養(yǎng)項目(RC2010-018)

1佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院2佳木斯大學(xué)附屬第二醫(yī)院

第一作者：楊笑天(1973-)，女，醫(yī)學(xué)碩士，副主任醫(yī)師，主要從事糖尿病眼病的研究。