楊曉穎　劉　寧　黃岑漢　劉燕平　黃忠仕

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西　南寧　530000)

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二苯乙烯苷對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠APP、PS1基因表達的影響

楊曉穎劉寧1黃岑漢1劉燕平黃忠仕1

(廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西南寧530000)

〔摘要〕目的探討何首烏提取物二苯乙烯苷(TSG)對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中β淀粉樣前體蛋白(APP)和早老素-1(PS1)基因的表達變化。方法3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠50只，隨機分為APP/PS1對照組、石杉堿甲組和TSG高、中、低(0.3、0.1、0.033 g/kg )劑量組，另取同齡C5B7L/6J小鼠10只為正常對照組。分別給予相應(yīng)藥物60 d后，應(yīng)用FQ-PCR法檢測腦組織中APP、PS1 mRNA的表達。結(jié)果與APP/PS1對照組比較，TSG高、中、低各劑量組以及石杉堿甲組APP、PS1mRNA表達均明顯下調(diào)(P<0.01或P<0.05)；TSG各劑量組與石杉堿甲組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論二苯乙烯苷可對阿爾茨海默病起到一定防治保護作用，其機制可能與APP、PS1基因受到明顯抑制有關(guān)。

〔關(guān)鍵詞〕二苯乙烯苷；阿爾茨海默病；β淀粉樣前體蛋白；早老素-1

阿爾茨海默病(AD)是一種進行性的不可逆的神經(jīng)退行性疾病，現(xiàn)已成為嚴重威脅老年人健康的四大疾病之一〔1〕。二苯乙烯苷(2,3,5,4，-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，TSG)是中藥何首烏的主要水溶性成分，具有抗衰老、神經(jīng)保護、降血脂及抗動脈硬化等作用〔2,3〕。本實驗重在探討TSG對APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠腦保護作用的可能機制，為TSG的臨床應(yīng)用和新藥的研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1動物APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠和C5B7L/6J，雄性，體重26~30 g，SPF級，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供(動物質(zhì)量許可證號 SCXK(京)2014-0004)。

1.2藥物及試劑TSG(成都克洛瑪生物科技有限公司，批號 14112)，石杉堿甲(河南太龍藥業(yè)股份有限公司，批號：H10940156)，總RNA提取試劑盒(TaKaRa MiniBEST Uniwersal RNA Extaraction Kzit,code No.9767),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa PrimeScriptTMRT reagent Kit With gDNA Eraser Perfect Real Time,Code No,RR047A),實時熒光定量試劑盒(TaKaRa SYBR×R Premix Ex TaqTMⅡ TLi R Nase H Plus,Code,No,RR820A),均購自大連寶生物有限公司。

1.3儀器超低溫冰箱(日本SANYO公司，型號：MDF-u72v)，制冰機(日本SANYO公司，型號：SIM-F124)，漩渦混合器(上海琪特分析儀器有限公司，型號：XW-80A)，高速冷凍離心機(美國 Sigma 公司，型號：1-14K)，超微量分光光度計(德國IMPLEN公司，型號：Nanophtoometer Pearl360)，全自動凝膠成像系統(tǒng)(培清科技，型號：JS-680B)，電泳儀(北京六一儀器廠，型號：DYY-6D)，普通梯度PCR儀(美國BIO-RAO公司，型號：PTC-200)，Real Time PCR儀(美國BIO-RAO公司，型號：IQ5)。

1.4動物分組與給藥3月齡APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因雄性小鼠50只，隨機分為APP/PS1對照組、石杉堿甲(陽性藥對照)組和TSG高、中、低劑量(0.3、0.1、0.033 g/kg)組，每組10只。另外，選擇3月齡C5B7L/6J雄性小鼠10只，作為正常對照組。APP/PS1對照組、正常對照組：予生理鹽水30 ml/kg，以上各組每日灌胃給藥l次，連續(xù)60 d。

1.5檢測指標及方法灌胃給藥第60天后，處死小鼠，取腦裝于凍存管中迅速置于-80℃冰箱保存。取小鼠腦組織含海馬區(qū)，液氮研磨后提取總RNA，紫外分光光度分析及瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA濃度、純度、完整性。根據(jù)cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。引物由大連寶生物有限公司設(shè)計合成,序列如表1。

表1　PCR反應(yīng)引物

冰上配置反應(yīng)體系：SYBR× R Premix Ex TaqTM(2×)10 μl，上下游引物各0.8 μl，cDNA模板2 μl，加dH2O至總反應(yīng)體系為20 μl。反應(yīng)條件(二步法擴增條件)：第1步：預(yù)變性，95℃ 30 s,1個循環(huán)。第2步:95℃，5 s,61℃，30 s，共40個循環(huán)。55℃，30 s，共81個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參通過2-△△CT法表示目的基因mRNA的相對表達水平?！鰿Tintervention= CTinterventionAPP-CTinterventionGAPDH，△CTblank=CTblankAPP-CTblankGAPDH，△△CT=△CTintervention-△CTblank。APP mRNA 表達差別倍數(shù)以2-△△CT法表示。PS1 mRNA計算同前。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠電泳。

1.6統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS17.0軟件，多組計量資料采用ANOVA檢驗，多樣本均數(shù)的兩兩比較采用SNK檢驗。

2結(jié)果

A：APP/PS1對照組；B：正常對照組；C:石杉堿甲組；D：TSG高劑量組；E:TSG中劑量組；F:TSG低劑量組；M：marker圖1　2%凝膠電泳圖分析APP(A)與PS1(B)PCR擴增產(chǎn)物

2.1PCR 產(chǎn)物鑒定根據(jù)本實驗設(shè)計，引物APP、PS1、GAPDH擴增產(chǎn)物長度分別為193、129、90 bp。產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳，紫外線下掃描分析，在相應(yīng)片段處均出現(xiàn)清晰的條帶并與設(shè)計相符，未見其他擴增產(chǎn)物(見圖1)。溶解曲線呈單一峰，說明產(chǎn)物特異性強，無非特異性擴增和引物二聚體產(chǎn)生。2.2對APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織 APP mRNA表達的影響APP/PS1對照組與正常對照組比較有顯著差異(P<0.01)。TSG高、中、低劑量各組和石杉堿甲組APP、PS1 mRNA相對表達量均低于APP/PS1對照組(P<0.05，P<0.01)。表明給予TSG后可使PS1 mRNA下調(diào)。TSG各劑量組與石杉堿甲組比較無明顯統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1　TSG對各組小鼠APP、PS1 mRNA表達的影響

與APP/PS1對照組比較：1)P<0.05,2)P<0.01

3討論

在眾多與AD相關(guān)的基因中，APP是第一個被發(fā)現(xiàn)的。APP基因位于第21號染色體，由19個外顯子構(gòu)成，AD患者大腦中大量沉積的Aβ就是由APP基因的第16、17號外顯子所編碼〔4〕。Aβ是構(gòu)成老年斑的核心成分，由APP水解產(chǎn)生。APP的異常代謝及Aβ的過度產(chǎn)生是AD發(fā)病的重要病理機制〔5〕。APP有兩條代謝途徑，在APP基因突變、炎癥等病理情況下，Aβ經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶剪切產(chǎn)生〔6〕。γ-分泌酶為一種天冬氨酸水解酶，是兩條途徑都需要的重要水解酶，PS1是γ-分泌酶的催化組分〔7~9〕。研究表明：缺失PS1的細胞分泌Aβ的能力會大大降低〔10〕。因此PS1也成為研究AD的重要靶點之一。AD動物模型良多，相較其他動物模型APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)不僅出現(xiàn)Aβ沉積、形成Aβ斑塊時間早，而且Aβ的量多，并伴有神經(jīng)細胞損傷和突觸丟失以及與年齡有關(guān)的神經(jīng)行為功能障礙等，因而是重要的模型之一〔11〕。TSG是傳統(tǒng)中藥何首烏的有效水溶性成分。近期研究表明TSG具有重要的腦保護作用〔12〕，且能抑制APP、PS1基因的產(chǎn)生，對AD有顯著的防治作用〔13〕。TSG還具有抗氧化，抗炎，抗動脈粥樣硬化等作用。

本次實驗結(jié)果表明，TSG可使APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠腦組織中APP和PS1基因表達均受到明顯抑制，說明TSG對AD具有一定的治療保護作用，但作用機制還有待深入研究。

4參考文獻

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〔2015-01-30修回〕

(編輯曲莉)

Effect of TSG on gene expression of APP and PS1 in APP/PS1 double transgenic mice

YANG Xiao-Ying,LIU Ning,HUANG Cen-Han,etal.

Guangxi University of Traditional Chinese Medicine,Nanning 530000,Guangxi,China

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of TSG which extraction from Polygonum multiflorum Thunb on gene expression of β-amyloid precursor protein(APP) and presenilin-1(PS1) in APP/PS1 double transgenic mice brain tissues.MethodsFifty three-months-old APP/PS1 double transgenic mice were randomly divided into five different groups：APP/PS1 control,huperzine A,high-,mid- and low-dose of TSG(0.3,0.1,0.033 g/kg) groups,with 10 mice in each group.Another 10 same age C5B7L/6J mice were assigned into normal control group.After medication corresponding drugs for 60 days,expressions of APP and PS1 mRNA in brain tissue were assayed by fluorescent quantitative-PCR.ResultsCompared with APP/PS1 control group,the expressions of APP and PS1 mRNA in all dose of TSG group and huperzine A group were down-regulated,the differences had statistical significances(P<0.01 or P<0.05);Compared with huperzine A group,all dose of TSG had no significant difference(P>0.05).ConclusionsTSG has certain preventive and therapeutic effect on Alzheimer's disease,which may be related to the inhibition of the expressions of APP and PS1 mRNA.

【Key words】2,3,5,4'-tetrahydroxy-stilbene-2-O-β-D-glycoside(TSG);Alzheimer's disease;β-amyloid precursor protein(APP);Presenilin-1(PS1)

〔中圖分類號〕R749

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1573-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.016

通訊作者：黃忠仕(1970-)，男，醫(yī)學(xué)博士，教授，主要從事抗癡呆藥物研究。

基金項目：國家自然科學(xué)基金項目(81260495)；廣西自然科學(xué)基金項目(2013GXNSFAA019212)

1右江民族醫(yī)學(xué)院

第一作者：楊曉穎(1990-)，女，在讀碩士，主要從事中醫(yī)診法與辨證的客觀化規(guī)范化研究。