曾　莉　樂音子　李文林　顏　帥　卞堯堯　宗　陽

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇　南京　210023)

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脂多糖對原代大鼠腹膜間皮細(xì)胞IL-1β和IL-6表達(dá)的影響

曾莉樂音子1李文林顏帥1卞堯堯宗陽

(南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇南京210023)

〔摘要〕目的研究原代腹膜間皮細(xì)胞(PMCs)對不同濃度脂多糖(LPS)刺激的反應(yīng)效果，探討術(shù)后腹腔粘連體外細(xì)胞最佳造模方法。方法運(yùn)用不同濃度LPS于不同時(shí)間點(diǎn)刺激PMCs，ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中白介素(IL)-1β、IL-6蛋白含量，qRT-PCR檢測IL-1β、IL-6 mRNA水平，掃描電鏡觀察LPS刺激前后PMCs的活性變化情況。結(jié)果ELISA測得各組大鼠PMCs培養(yǎng)上清液IL-1β和IL-6濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間推移和LPS濃度增加而表現(xiàn)出明顯差異(P<0.01)，尤其以24 h、10 μg/ml為LPS最佳刺激時(shí)間和最佳刺激濃度；qRT-PCR實(shí)驗(yàn)中 LPS最佳刺激時(shí)間為24 h，但是最佳刺激濃度為5 μg/ml；正常PMCs掃描電鏡下表面被豐富的微絨毛覆蓋；LPS刺激后PMCs剝脫、腫脹明顯，具有細(xì)胞間隙，偶見基底膜。結(jié)論LPS能夠刺激大鼠PMCs誘發(fā)炎癥損傷，進(jìn)一步放大炎癥反應(yīng)，模擬術(shù)后腹腔粘連微環(huán)境，作為術(shù)后腹腔粘連體外細(xì)胞模型。

〔關(guān)鍵詞〕腹腔粘連；腹膜間皮細(xì)胞；IL-1β；IL-6；脂多糖

腹膜間皮細(xì)胞(PMCs)具有調(diào)節(jié)、合成纖溶成分，分泌多種細(xì)胞因子以維持腹腔內(nèi)局部微環(huán)境的作用。PMCs的完整性及功能正常與否是腹腔粘連形成的關(guān)鍵因素〔1〕。術(shù)后氧化應(yīng)激和炎癥因子等因素的影響下，PMCs增殖和修復(fù)的數(shù)目與術(shù)后腹腔粘連程度呈正相關(guān)。本實(shí)驗(yàn)擬以脂多糖(LPS)刺激PMCs，觀察并探討大鼠PMCs對LPS的刺激效果，尋找腹腔粘連體外模型最佳造模方法以及LPS的最佳刺激時(shí)間和劑量。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1動物雄性清潔級別SD 大鼠(原代細(xì)胞用)，體質(zhì)量 160~180 g，由上海杰思捷實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，許可證號：SCXK(滬)2012-0006。

1.1.2試劑DMEM/F12培養(yǎng)基(LOT：8113397，Gibco)，胎牛血清(LOT：1133067，Gibco)，青霉素、鏈霉素(Gibco)，LPs(Escherichia coli 0111：B4，L4391-1MG，Sigma，USA)，D-Hank液體(LOT：8113400，Gibco),0.25% 胰蛋白酶-EDTA(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)，大鼠白介素(IL)-1β、IL-6 ELISA試劑盒(上海巧伊生物科技有限公司)，多聚甲醛(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)，多聚賴氨酸(Sigma)，紅細(xì)胞裂解液(南京凱基生物科技有限公司)，乙醚(上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)，總RNA快速提取試劑盒(上海捷瑞生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo Scientific Fisher公司)，qPCR SuperRealPreMix Plus(SYBR Green)(TIANGEN)，滅菌注射用水(安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司)，RNAiso Plus(Takara Bio Inc)，PBS緩沖液(自配)。各種免疫組化染色一抗、抗角蛋白(Keratin)抗體、抗波形蛋白(Vitamin)抗體、抗白細(xì)胞CD45 抗體、抗第Ⅷ因子(Factor Ⅷ)抗體及 SABC 試劑盒(武漢博士德公司)。

1.1.3儀器50 ml一次性使用無菌注射器(江蘇華達(dá)醫(yī)療器械有限公司)，一次性使用醫(yī)用橡膠檢查手套(江蘇鎮(zhèn)江華揚(yáng)乳膠制品有限公司)，CPA224S電子分析天平(北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)，自動洗板機(jī)(江蘇華東電子)，電恒水浴鍋、精密鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，CKX31倒置式生物顯微鏡(日本 OLYMPUS公司)，精密移液器、常溫低速離心機(jī)(德國 Eppendorf 公司)，垂直流超凈工作臺(新加坡藝思高科技有限公司)，CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國Thermo Scientific公司)，Synergy 2全自動酶標(biāo)儀(美國 Bio-Tek公司)，純水儀(美國Millipore公司)，全自動高壓滅菌鍋(日本SANYO公司)，25 cm2培養(yǎng)瓶、96孔培養(yǎng)板(美國Coring公司)，一次性無菌移液管(規(guī)格2.5 ml，北京漢宸創(chuàng)展科技有限公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代及鑒定細(xì)胞實(shí)驗(yàn)前1 d，用終濃度為0.01 mg/ml多聚賴氨酸(200 μl 1 mg/ml多聚賴氨酸+1.8 ml PBS)鋪于CO2培養(yǎng)瓶中，置于37℃，5% CO2，濕度為95%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)30 min，然后將其移至超凈臺風(fēng)干，4℃下儲存?zhèn)溆?。參考文獻(xiàn)〔2~4〕基礎(chǔ)上，無菌棉球浸于3~5 ml乙醚原液，丟入真空干燥器中。將大鼠放置于真空干燥器中，3 min后大鼠站立失衡，全身癱軟(注意勿使大鼠吸入過多乙醚致死)。取出大鼠，碘伏消毒腹部皮膚3遍，75%乙醇脫碘3遍后，無菌紗布擦干，將25~30 ml 0.25%胰蛋白酶-0.02% EDTA 消化液沿腹正中線偏右側(cè)進(jìn)針腹腔注射，75%乙醇浸泡10 min，2 h后超凈臺中無菌打開腹腔，無菌吸管吸取腹腔液至15 ml離心管，若肉眼可見紅細(xì)胞，則加入1~2倍體積的紅細(xì)胞裂解液冰上裂解2 min，D-Hank液清洗，1 500 r/min離心10 min，棄上清，D-Hank液將細(xì)胞洗一遍，離心棄上清，以含15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，37℃，5% CO2，濕度為95%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。24 h后，細(xì)胞基本貼壁，3 d后細(xì)胞完全貼壁后可換液，以后每2 d換液1次，約培養(yǎng)5~7 d細(xì)胞融合至90%以上后可傳代培養(yǎng)。3 d后首次換液，以后根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)每2~3 d換液1次，取第2代細(xì)胞經(jīng)倒置顯微鏡觀察并采用免疫組化方法對大鼠腹膜間皮細(xì)胞進(jìn)行抗角蛋白、抗波形蛋白抗體、抗白細(xì)胞CD45抗體、抗第Ⅷ因子等相關(guān)抗原鑒定。取第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2掃描電鏡制備使大鼠PMCs生長在被多聚賴氨酸包被的0.5 cm×0.5 cm大小的載玻片上，4℃ PBS洗3次，2.5%的戊二醛固定液4℃固定2 h，4℃下PBS反復(fù)沖洗2次，每次5 min，1%鋨酸溶液固定4 h，4℃ PBS反復(fù)沖洗2次，50%、70%、90%及100%乙醇逐級脫水，每次5 min，臨界點(diǎn)干燥樣品，離子濺射，真空噴鍍金后進(jìn)行掃描電鏡觀察細(xì)胞表面形態(tài)。

1.2.3分組與處理選取狀態(tài)良好的對數(shù)生長期大鼠PMCs，0.25%胰蛋白酶消化后制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度，第3代大鼠PMCs以 1×106/ml接種于六孔培養(yǎng)板中，每孔加入2 ml DMEM/F12 培養(yǎng)液，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待PMCs融合度至90%時(shí)，更換0.5 % 胎牛血清的 DMEM/F12培養(yǎng)液以同步化24 h后，使參照文獻(xiàn)〔5~8〕隨機(jī)分組：①正常對照組：只含DMEM/F12培養(yǎng)液；②1 μg/ml組：加含終濃度為LPS 1 μg/ml、DMEM/F12培養(yǎng)液；③5 μg/ml組：加含終濃度為LPS 5 μg/ml、DMEM/F12培養(yǎng)液；④10 μg/ml組：加含終濃度為LPS 10 μg/ml、DMEM/F12培養(yǎng)液；接種后將培養(yǎng)板放入37℃，5% CO2，濕度為95%的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)，各組分別培養(yǎng)4、6、12、24 h后，細(xì)胞培養(yǎng)液上清和細(xì)胞分別用于后續(xù)檢測。

1.2.4實(shí)時(shí)定量RT-PCR(qRT-PCR)檢測各組細(xì)胞IL-1β和IL-6 mRNA的表達(dá)收集各組細(xì)胞約106~107，按照說明書利用Trizol試劑盒抽取細(xì)胞總RNA。定量逆轉(zhuǎn)錄PCR使用Ribolock TM cDNA 合成試劑盒。采用 SYBR Premix Ex Taq和 iQ5 實(shí)時(shí)定量 PCR檢測系統(tǒng)(BioRad)。β-actin作為內(nèi)對照。

β-actin引物正義：5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反義：5’-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。IL-1β引物正義：5’-TCCTCTGTGACTCGTGGGAT-3’，反義：5’-TCAGACAGCACGAGGCATTT-3’。IL-6引物正義：5’-CACTTCACAAGTCGGAGGCT-3’，反義：5’-TCTGACAGTGCATCATCGCT-3’(上海桑尼生物科技有限公司合成)。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：mRNA樣品11 μl，Ribolock逆轉(zhuǎn)錄酶 1 μl，Ribolock反應(yīng)混合物 4 μl，加無RNase 的雙蒸水至20 μl，輕輕振蕩混勻，25℃干浴5 min，42℃干浴60 min，70℃干浴5 min。實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)：cDNA逆轉(zhuǎn)錄8 μl，正反義引物各1 μl，SYBR預(yù)混劑10 μl。PCR反應(yīng)程序：50℃，3 min；95℃，3 min；95℃，10 s；59℃，20 s；72℃，30 s；95℃，3 min；運(yùn)行45個(gè)循環(huán)。每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。采用Delta-delta Ct法分析目的基因的相對表達(dá)量，根據(jù)擴(kuò)增的目的基因和管家基因的Ct值，利用下述公式計(jì)算所擴(kuò)增的目的基因相對于管家基因的變化倍數(shù)。F=2-ΔΔCt，ΔΔCt=實(shí)驗(yàn)組(CT目的基因-CT內(nèi)參)-對照組(CT 目的基因-CT內(nèi)參)。

1.2.5采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測各組細(xì)胞上清液中IL-1β和IL-6的含量收集各組不同條件下培養(yǎng)的PMCs上清液，以4 000 r/min，離心10 min，再取上清液于-80℃低溫保存。嚴(yán)格按照 ELISA 試劑盒說明書測定細(xì)胞上清液中IL-1β、 IL-6 的含量，經(jīng)過徹底洗滌后用底物四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色。TMB 在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的IL-1β、 IL-6含量呈正相關(guān)，以此反映大鼠PMCs的IL-1β、 IL-6蛋白表達(dá)水平。顯色后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測定 OD 值，再以建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出檢測指標(biāo)的真實(shí)含量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS15.0軟件行單因素方差分析，兩兩比較組間采用LSD法。

2結(jié)果

2.1倒置顯微鏡下觀察大鼠PMCs在倒置顯微鏡下觀察24 h后貼壁的大鼠原代細(xì)胞，培養(yǎng)初期呈梭形及橢圓形，1 w后融合成多邊形細(xì)胞，外觀如鋪路鵝卵石樣，為典型的PMCs的外形，形狀多邊形，大小形態(tài)較一致，見圖1。

2.2免疫組化鑒定大鼠PMCs光鏡下觀察鑒定的細(xì)胞角蛋白和波形蛋白染色均呈棕色，而第Ⅷ因子相關(guān)抗原及CD45抗原染色均為陰性。見圖1。

A，B：倒置顯微鏡下PMCs的形態(tài)；C：Keratin(+)；D：Vitamin(+)；E：CD45(-)；F：第Ⅷ因子(-)圖1　原代PMCs培養(yǎng)形態(tài)及免疫組化鑒定圖

2.3掃描電鏡下LPS刺激前后大鼠PMCs變化情況正常大鼠PMCs的表面被豐富的微絨毛所覆蓋，PMCs未見明顯腫脹，細(xì)胞膜無凹陷；而LPS刺激后PMCs剝脫、腫脹明顯，具有細(xì)胞間隙，偶見基底膜，見圖2。

圖2　LPS刺激前、后原代PMCs形態(tài)變化(×3 000)

2.4RT-PCR檢測各組細(xì)胞中IL-1β、 IL-6 mRNA表達(dá)水平與NC組相比，LPS刺激4 h時(shí)僅有10 μg/ml LPS刺激組IL-1β mRNA表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著刺激濃度的遞加，6 h時(shí)5、10 μg/ml LPS組與NC組相比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，12 h時(shí)僅有5 μg/ml LPS刺激組與NC組相比具有差異；直至24 h，三個(gè)劑量組與NC組相比均有顯著差異(P<0.01)，以5 μg/ml LPS刺激組最為明顯，見表1。IL-6 mRNA在LPS刺激PMCs后，4 h三個(gè)刺激組均無明顯變化(P>0.05)；與NC 組相比，6 h僅有5 μg/ml LPS組IL-6 mRNA有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；12 h和24 h時(shí)IL-6 mRNA濃度隨著LPS刺激量而逐漸升高(P<0.01)，見表2。

表1　不同時(shí)間點(diǎn)PMCs上清液IL-1β mRNA水平

與NC組相比：1)P<0.05，2)P<0.01；下表同

表2　不同時(shí)間點(diǎn)PMCs上清液IL-6 mRNA水平

2.5ELISA檢測各組細(xì)胞中IL-1β、 IL-6蛋白表達(dá)水平見表3，

表3　不同時(shí)間點(diǎn)各組上清液IL-1β蛋白表達(dá)水平±s)

表4。IL-1β和IL-6濃度隨著LPS的刺激量而逐漸升高，與同時(shí)間點(diǎn)NC組相比，以24 h時(shí)10 μg/ml組差異最明顯(P<0.01)。

表4　不同時(shí)間點(diǎn)各組上清液IL-6蛋白表達(dá)水平±s)

3討論

采用術(shù)后動物模型探討腹腔粘連的發(fā)病機(jī)制，對于掌握腹腔粘連發(fā)病的細(xì)胞和分子學(xué)機(jī)制有其局限性，某種程度上制約研發(fā)及評價(jià)藥物等治療措施。因此，構(gòu)建理想的腹腔粘連體外細(xì)胞模型是關(guān)鍵所在，可作為抗腹腔粘連手段篩選的重要工具。本實(shí)驗(yàn)以培養(yǎng)體系穩(wěn)定的大鼠腹膜間皮細(xì)胞為對象，盡可能模擬術(shù)后腹腔粘連的致病因素和病理過程。PMCs作為腹腔粘連形成的重要細(xì)胞，是諸多細(xì)胞因子首先侵及的對象，PMCs的超微結(jié)構(gòu)的破壞和凋亡直接決定腹腔粘連的程度，楊麗娜等〔5〕采用LPs作用于大鼠PMCs發(fā)現(xiàn)LPS能抑制大鼠PMCs增殖、促進(jìn)其凋亡，與有關(guān)文獻(xiàn)〔8〕研究結(jié)果一致。故本實(shí)驗(yàn)考慮采用LPs刺激大鼠PMCs構(gòu)建細(xì)胞模型。

IL-6是一種類似生長或分化因子、刺激其他基因表達(dá)的一種多功能細(xì)胞因子，是組織損傷的早期標(biāo)志，由間皮細(xì)胞中IL-1和TNF-α刺激分泌〔9，10〕。腹膜損傷后由巨噬細(xì)胞釋放TNF-α和IL-6，在凝血調(diào)節(jié)和纖維蛋白形成中發(fā)揮重要的作用，直至粘連形成。與正常腹膜成纖維細(xì)胞相比，IL-6水平在粘連成纖維細(xì)胞顯著升高〔11〕。當(dāng)手術(shù)后機(jī)體暴露于缺氧狀態(tài)，血漿中可溶性ICAM-1，TNF-α和IL-6細(xì)胞因子迅速升高〔12〕，腹腔液中IL-1β、IL-6、IFN-γ、TNF-α、TGF-β1等細(xì)胞因子水平也逐漸升高〔13，14〕，細(xì)胞層面上在正常腹膜成纖維細(xì)胞和黏附成纖維細(xì)胞IL-6水平均升高，但更大程度上是在正常成纖維細(xì)胞上升高明顯〔11〕。IL-1在啟動免疫反應(yīng)中起著重要作用，且與腹腔粘連的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Saba等〔10〕研究表明IL-1和TNF-α可作為人腹腔粘連組織形成的生物標(biāo)記物，且應(yīng)用IL-1抗體可一定程度上減輕腹腔粘連的形成。

本研究表明，開腹前后PMCs形態(tài)學(xué)發(fā)生變化，手術(shù)損傷腹膜引起PMCs形態(tài)損傷，但損傷的程度未做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。24 h 10 μg/ml為LPS最佳刺激時(shí)間和最佳刺激濃度。而RT-PCR結(jié)果與ELISA結(jié)果并不完全一致，雖然LPS最佳刺激時(shí)間為24 h，但是最佳刺激濃度卻為5 μg/ml。以DMEM/F12作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，培養(yǎng)體系穩(wěn)定、操作簡單，細(xì)胞貼壁迅速，活力較高。不同濃度的LPS對大鼠PMCs的影響不同，隨著LPS濃度的增加，PMCs活力變差，當(dāng)LPS增加到5 μg/ml和10 μg/ml時(shí)候，PMCs活中的IL-1β和IL-6蛋白升至最高。分析其原因可能是基因變化要比蛋白表達(dá)快且敏感，因?yàn)榇嬖谵D(zhuǎn)錄后調(diào)控、翻譯后修飾等，PCR結(jié)果往往和蛋白檢測結(jié)果不一致。本實(shí)驗(yàn)采取LPS刺激PMCs，發(fā)現(xiàn)與上述文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相似，故可暫定腹腔粘連體外細(xì)胞模型構(gòu)建成功。

4參考文獻(xiàn)

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〔2015-11-19修回〕

(編輯李相軍)

Effect of lipopolysaccharide on the expressions of IL-1β and IL-6 in rat peritoneal mesothelial cells

ZENG Li, LUE Yin-Zi,LI Wen-Lin,etal.

Nanjing University of Chinese Medicine, Nanjing 210023, Jiangsu, China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the stimulating effects of lipopolysacchride (LPS) on the expressions of IL-1β and IL-6 in rat peritoneal mesothelial cells(RPMCs).MethodsDifferent concentrations of LPS was used to stimulate RPMCs at different time points, the protein and mRNA levels of IL-Iβ, IL-6 were detected respectively by ELISA and qRT-PCR. Morphological changes were observed under scanning electron microscope.ResultsIL-Iβ and IL-6 concentrations were increased with the stimulation time and LPS concentration(P<0.01). The best stimulation time was 24 hours and the best stimulus concentration was 10 μg/ml. Normal RPMCs manifestations were covered by abundant microvilli. However, LPS stimulated RPMCs appear stripping, swelling significantly, with the gap and the basement membrane.ConclusionsRPMCs could induce inflammation injury stimulated by LPS, further amplifying inflammatory response.

【Key words】Peritoneal adhere; Peritoneal mesothelial cell;IL-1β;IL-6; Lipopolysacchride

〔中圖分類號〕R641

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1560-04；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.011

通訊作者：顏帥(1986-)，男，博士，主治中醫(yī)師，主要從事中醫(yī)藥防治術(shù)后創(chuàng)面修復(fù)及結(jié)腸動力研究。

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(81373843)

1蘇州市中醫(yī)醫(yī)院

第一作者：曾莉(1962-),女,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事中醫(yī)藥防治術(shù)后腹腔粘連研究。