彭慧茹　吳賽珠　曹　楓

(深圳市龍崗中心醫(yī)院綜合ICU，廣東　深圳　518116)

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睪酮通過減少氧化應激干預血管內(nèi)皮細胞衰老

彭慧茹吳賽珠1曹楓

(深圳市龍崗中心醫(yī)院綜合ICU，廣東深圳518116)

〔摘要〕目的觀察睪酮對過氧化氫(H2O2)誘導衰老的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)的影響。方法用SA-βgal細胞化學檢測法觀察不同濃度睪酮及雄激素受體拮抗劑、雌激素受體拮抗劑對H2O2誘導的HUVECs衰老的干預作用，用2,7二氯氫化熒光素二酯(H2DCF-DA)染色檢測細胞內(nèi)活性氧簇(ROS)水平，用免疫印跡分析(Western印跡)法檢測細胞中去磷酸化Rb蛋白水平。 結(jié)果睪酮在3.0×10(-9)、3.0×10(-8)、3.0×10(-7) mol/L等3種濃度下均具有延緩H2O2誘導的HUVECs的SA-βgal陽性率明顯增加的趨勢；與3.0×10(-8) mol/L睪酮干預組相比，予10(-6) mol/L ICI182，780預處理，HUVECs的SA-βgal陽性率明顯增加，ROS水平增加，去磷酸化Rb蛋白水平明顯增加。結(jié)論睪酮對H2O2誘導的HUVECs衰老的影響與其劑量有關；生理濃度睪酮具有延緩H2O2誘導的HUVECs衰老的趨勢，其作用可能是通過轉(zhuǎn)化為雌激素，作用于雌激素受體，減少氧化應激和調(diào)節(jié)去磷酸化Rb蛋白產(chǎn)生。

〔關鍵詞〕睪酮；內(nèi)皮細胞；氧化應激；受體；衰老

隨著年齡的增長，男性體內(nèi)睪酮水平會發(fā)生明顯改變，以動脈粥樣硬化(AS)為表現(xiàn)的心腦血管疾病的發(fā)病率也明顯增加〔1〕。而且，AS產(chǎn)生的一個最有年齡性特點的原因是血管發(fā)生了明顯的結(jié)構(gòu)和功能的改變，血管細胞(包括血管內(nèi)皮細胞)出現(xiàn)衰老。這與血管的病理生理及衰老相關疾病如AS等有著密切的聯(lián)系，同時也可能是該類疾病隨著年齡的增長而發(fā)病率增加的原因之一〔2〕。但睪酮對血管內(nèi)皮細胞衰老的影響、其可能的作用機制如何，目前還沒有文獻報道。由于氧化應激是各種危險因素導致AS形成與發(fā)展的最關鍵環(huán)節(jié)之一，故本實驗主要從氧化應激角度出發(fā)，探討睪酮對H2O2誘導的血管內(nèi)皮衰老的干預作用及其可能的作用機制。

1材料和方法

1.1藥物配制稱取睪酮(Sigma公司)配制成3×10-2mol/L 濃度，用培養(yǎng)基將睪酮依次稀釋為3×10-6mol/L、3×10-7mol/L 和3×10-8mol/L、3×10-9mol/L。Flutamide、ICI182,780(Sigma公司)配制成10-2mol/L，均稀釋為10-6mol/L。

1.2細胞培養(yǎng)二代人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs，男性胎兒) 及其低血清培養(yǎng)基(美國Cascade Biologics 公司)。細胞復蘇后予10%胎牛血清的培養(yǎng)基，于37℃、5 %CO2培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng),所用細胞為4～6代。

1.3SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)染色先用MTT法觀察H2O2對內(nèi)皮細胞增殖率的影響，并選擇H2O2刺激濃度(預實驗得到的最佳刺激濃度和時間，H2O260 μmol/L，72 h)。當培養(yǎng)的細胞融合達80%時，換用無血清培養(yǎng)基靜止24 h,再按以下分組進行實驗：①正常對照組:給予低血清(2%)培養(yǎng)基;②H2O2刺激組:給予低血清培養(yǎng)基+ H2O2;③睪酮作用組：分別給予睪酮3.0×10-9mol/L、3.0×10-8mol/L、3.0×10-7mol/L和3.0×10-6mol/L培養(yǎng)30 min后，再加予H2O2；④機制研究組:分別給予ICI182,780、Flutamide 10-6mol/L 培養(yǎng)30 min后，給予睪酮(終濃度達3.0×10-8mol/L)，30 min后再給予H2O2。72 h后，漂洗、固定，予X-半乳糖苷酶(X-gal)染液孵育(按照試劑盒說明書操作，碧云天公司)。在顯微鏡下觀察并計數(shù)藍染的細胞(陽性細胞)，每次隨機挑選200個細胞，計數(shù)得到陽性細胞百分率。以上實驗步驟重復4次。

1.4ROS檢測按以下分組進行實驗：①正常對照組;②H2O2刺激組;③生理濃度睪酮作用組:給予睪酮3.0×10-8mol/L,培養(yǎng)30 min后，再加予H2O2；④機制研究組:分別給予ICI182,780、Flutamide、NAC 10-6mol/L 培養(yǎng)30 min后，ICI182,780、Flutamide組給予睪酮(終濃度達3.0×10-8mol/L)，30 min后再給予H2O2。72 h后漂洗，加入10 μmol/L的H2DCF-DA培養(yǎng)液1 ml,37℃避光孵育30 min，PBS漂洗后，在熒光顯微鏡下觀察測定綠色熒光強度平均光密度(激發(fā)波長為488 nm，吸收波長為525 nm，曝光時間為1 s,亮度、對比度固定)，每樣品取5個視野，綠色熒光強度平均光密度使用Image-Pro Plus6.0軟件進行定量分析。以上實驗重復2次。

1.5去磷酸化Rb蛋白檢測培養(yǎng)細胞達80 %融合時按上述方法靜止給予不同刺激。孵育72 h 后，行細胞裂解處理。然后各取25 μg 蛋白進行變性的8% SDS-polyacrylamide 凝膠電泳(Bio-Rad Mini protein Ⅲ System),隨后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜(美國Bio Rad公司產(chǎn)品),含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h,繼而與一抗(1∶200)室溫下孵育2 h(兔抗人去磷酸化Rb蛋白多克隆抗體為武漢博士德公司產(chǎn)品)，再與耦聯(lián)辣根過氧化物酶的羊抗兔IgG二抗(1∶2 000,武漢博士德公司產(chǎn)品) 室溫下孵育2 h ，最后用增強化學發(fā)光法(檢測試劑為美國Santa Cruz 公司產(chǎn)品) 顯色。圖像分析儀(美國UVIsoft軟件)定量測定雜交信號的吸光度，用面積×密度代表表達量，以Rb與β-actin吸光度百分比代表細胞中Rb的表達量，實驗數(shù)據(jù)以空白對照為1進行標化分析，其他各組值與空白對照組表達量比較，得出相對吸光度(A),以上實驗重復2次。

1.6統(tǒng)計分析采用SPSS15.0軟件，組間比較采用單向方差分析，用小顯著差異法(LSD)進行多重比較。

2結(jié)果

2.1SA-βgal細胞化學檢測與空白組〔(2.90±0.43)%,95%CI:1.71%~4.09%〕相比，H2O2刺激組陽性細胞率〔(57.10±1.03)%,95%CI:54.24%~60.00%〕增加(P<0.01)。3、30、300 nmol/L、3 μmol/L干預組SA-βgal細胞陽性率分別為(54.40±1.20)%,95%CI:51.07%~57.73%;(50.80±3.36)%,95%CI:41.47%~60.17%;(51.20±2.60)%,95%CI:60.81%~79.59%。生理濃度睪酮與稍高于或低于生理濃度睪酮都具有延緩H2O2誘導的HUVECs陽性細胞率增加的趨勢，其中生理濃度睪酮組效果最明顯，但與H2O2刺激組相比，統(tǒng)計學差異均不顯著，P分別為0.094、0.115、0.464。與生理濃度睪酮組相比，先給予雌激素受體拮抗劑ICI182，780預處理，細胞陽性細胞率明顯增加〔(67.00±2.82)%,95%CI:59.18%~74.81%〕；而予Flutaide預處理，細胞陽性率降低〔(42.90±3.62)%，95%CI：32.85%~52.95%〕(P<0.01)。

2.2睪酮、性激素受體拮抗劑及抗氧化劑對H2O2誘導的HUVECs內(nèi)ROS的影響HUVECs在不同處理組培養(yǎng)72 h后，經(jīng)過H2DCF-DA染色：與空白對照組(1.03±0.07,95%CI:0.72~1.33)相比，H2O2刺激組平均積分光密度(2.55±0.06，95%CI：2.29~2.82)明顯增加(P<0.001)；與H2O2刺激組相比，NAC能明顯抑制H2O2誘導的細胞內(nèi)ROS的增加，平均積分光密度明顯減少(1.83±0.08，95%CI：1.51~2.16)(P<0.01)；與3.0×10-8mol/L睪酮干預組(2.45±0.10，95%CI：2.01~2.88)相比，予雌激素受體拮抗劑ICI182,780預處理，會促進H2O2誘導的細胞內(nèi)ROS的增加，平均積分光密度明顯增加(2.89±0.10，95%CI：2.48~3.31)(P<0.01)；而先予Flutamide預處理，能減少H2O2誘導的細胞內(nèi)ROS的增加，平均積分光密度減小(2.04±0.06，95%CI：1.78~2.31)(P<0.01)。

2.3各種濃度睪酮對H2O2誘導的HUVECs的去磷酸化Rb蛋白表達的影響與空白對照組(1.15±0.08，95%CI：0.82~1.48)相比，H2O2誘導組的HUVECs中去磷酸化Rb蛋白的表達量(2.60±0.06，95%CI：2.35~2.86)明顯增加(P<0.01)；與H2O2刺激組相比，NAC組細胞的去磷酸化Rb蛋白表達量(1.27±0.05，95%CI1.04~1.51)顯著減少(P<0.01)；30 nmol/L睪酮干預組Rb蛋白的表達量(2.46±0.05，95%CI：2.23~2.68)稍減少，但差異無統(tǒng)計學差異(P=0.132)。與30 nmol/L睪酮干預組相比，予ICI182，780預處理，細胞的去磷酸化Rb蛋白表達量(10.01±0.09，95%CI：9.62~10.40)明顯增多(P<0.01)；而予Flutamide預處理，細胞的去磷酸化Rb蛋白表達量(1.58±0.04，95%CI：1.40~1.75)表達量減少(P<0.01)。見圖1。

1:NAC干預組;2:空白對照組;3:H2O2刺激組;4:睪酮30 nmol/L干預組;5:睪酮30 nmol/L+ICI組;6:睪酮30 nmol/L+Flu組圖1　Western印跡檢測各組細胞中Rb和β-actin表達

3討論

生物在正常的生長發(fā)育過程中，ROS的產(chǎn)生和清除會保持平衡，ROS的產(chǎn)生通過抗氧化系統(tǒng)的作用保持平衡。在病理狀態(tài)下，氧化劑超過抗氧化系統(tǒng)的清除能力，平衡被破壞，導致ROS過度產(chǎn)生稱為氧化應激，造成脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、膜和DNA的損傷。除了氧化應激造成損傷外，ROS更重要的性能是作為信息分子，通過蛋白質(zhì)氧化修飾角度對細胞功能，如細胞生長、轉(zhuǎn)化、凋亡、轉(zhuǎn)錄和衰老進行調(diào)節(jié)〔3〕。同時，目前關于細胞衰老的信號傳導通路研究中，研究較多且較確定的是p53-p21-Rb通路和p16-Rb通路〔4〕。去磷酸化Rb蛋白在這兩條重要通路中都處于中樞地位。在衰老細胞中，Rb蛋白以其未磷酸化的活性狀態(tài)存在，抑制細胞生長〔5〕。

本研究通過小劑量H2O2長時間刺激，成功誘導出衰老的HUVECs模型。本實驗結(jié)果顯示，與空白對照組相比，H2O2刺激組HUVECs 內(nèi)ROS水平、去磷酸化Rb蛋白的表達量明顯增加。與H2O2刺激組相比，給予抗氧化劑NAC能明顯減少細胞內(nèi)ROS水平與去磷酸化Rb蛋白的表達。這證明了ROS在人血管內(nèi)皮細胞衰老過程中起著重要作用，這與我們前期研究已證明的ROS可以通過影響鼠的血管NO信號途徑影響血管增齡改變的結(jié)果是一致的〔6〕。與H2O2刺激組相比，生理濃度和稍高于或低于生理濃度的睪酮都具有延緩H2O2引起的HUVECs的SA-βgal染色陽性率增加的趨勢，其中生理濃度睪酮效果最明顯，而且生理濃度睪酮還具有減少細胞內(nèi)ROS和去磷酸化Rb蛋白的表達的趨勢。但較高濃度的睪酮卻可以促進H2O2誘導的HUVECs的SA-βgal染色陽性率的增加。此外，與3.0×10-8mol/L睪酮干預組相比，先予雌激素受體拮抗劑ICI182,780預處理，會增加SA-βgal染色陽性細胞比例、細胞內(nèi)ROS量和去磷酸化Rb蛋白的表達；而先予雄激素受體拮抗劑Flutamide預處理，則具有相反的作用。以往實驗已證明，睪酮不僅可以通過血管壁的雄激素受體產(chǎn)生作用，還可以在脈管系統(tǒng)的芳香酶作用下轉(zhuǎn)化為雌激素，通過血管壁的雌激素受體發(fā)揮生物學效能。由此推斷，生理濃度的睪酮或許能通過芳香化轉(zhuǎn)化為雌二醇后，作用于雌激素受體，減少細胞內(nèi)的氧化應激，減少細胞內(nèi)去磷酸化Rb蛋白表達，從而影響細胞周期，干預細胞衰老。

4參考文獻

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〔2015-11-10修回〕

(編輯郭菁)

Effects of testosterone on vascular endothelial cells senescence by reducing oxidative stress

PENG Hui-Ru,WU Sai-Zhu,CAO Feng.

ICU of Shenzhen Longgang Central Hospital,Shenzhen 518116,Guangdong,China

【Abstract】ObjectiveTo investigate the effects of testosterone on the senescence of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs) induced by hydrogen peroxide(H2O2) and initially investigate the mechanism of act of testosterone at physiological concentration on it.MethodsEffects of testosterone at different concentrations with or without its antagonist Flutamide or estrogen receptors antagonist ICI182,780 on the senescence of HUVECs induced by H2O2 were studied by means of SA-β galactosidase staining,the level of reactive oxygen species(ROS) were also detected by 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate staining and the expression of hypophosphorylation of pRb by Western blot.ResultsH2O2(60 μmol/L,72 h)increased positive rate of SA-β galactosidase staining of HUVECs，as well as increased ROS level and hypophosphorylation of pRb expression.Testosterone at low concentrations(3×10(-9) mol/L,3×10(-8)mol/L and 3×10(-7)mol/L) delaying increased positive rate of SA-β galactosidase staining of HUVECs induced by H2O2,most obviously at concentration of 3×10(-8)mol/L(but P>0.05 versus H2O2 stimulated group),whereas higher concentration(3×10(-6)mol/L) had opposite effect(70.20±3.40 for SA-βgalactosidase staining method,P<0.001 versus H2O2 stimulated group).The estrogen receptors antagonist ICI182,170 rather than androgen antagonist Flutamide at concentration of 10(-6)mol/L inhibited the delaying trend induced by testosterone at concentration of 3×10(-8)mol/L,as well as increased ROS level and hypophosphorylation of Rb expression in HUVECs(67.00±2.82 for SA-βgalactosidase staining method,2.89±0.10 for H2DCF-DA staining method,10.24±0.20 for Western blot,P<0.01 versus testosterone at concentration of 3×10(-8)mol/L group) .ConclusionsTestosterone modulates the senescence of HUVECs induced by H2O2 in a dose-related manner.And at physiological concentrations,testosterone has the trend of delaying it,mainly by transforming to estrogen acting on estrogen receptors decreasing oxidative stress and modulating hypophosphorylation of Rb expression consequently.

【Key words】Testosterone;Endothelial cell;Oxidative stress;Receptor;Senescence

〔中圖分類號〕R329.2

〔文獻標識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1552-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.007

通訊作者：吳賽珠(1962-)，女，博士，教授，博士生導師，主要從事性激素平衡與多種老年疾病關系的基礎與臨床系列研究。

基金項目：國家“973”項目子課題(No:2007CB507404)

1南方醫(yī)科大學附屬南方醫(yī)院

第一作者：彭慧茹(1982-)，女，主治醫(yī)師，主要從事動脈粥樣硬化與衰老的關系及其機制研究。