孫彥輝　梁玉磊　張　闖　邢海嬌　張　茜　張佳音　張會(huì)珍　馬小順

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北　石家莊　050200)

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不同時(shí)間電針對(duì)血管性癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶能力與海馬氧自由基的影響

孫彥輝梁玉磊張闖邢海嬌張茜1張佳音1張會(huì)珍馬小順

(河北中醫(yī)學(xué)院，河北石家莊050200)

〔摘要〕目的通過(guò)觀察不同時(shí)間電針對(duì)血管性癡呆(VD)模型小鼠行為學(xué)與海馬超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)的含量變化，探討電針干預(yù)對(duì)VD的治療效應(yīng)及可能的作用機(jī)制。方法采用頸總動(dòng)脈結(jié)扎缺血再灌注的方法復(fù)制VD模型，將小鼠隨機(jī)分為兩批，第1批于造模當(dāng)日給予電針干預(yù)，第2批于造模第3天給予電針干預(yù)，并設(shè)假手術(shù)組、模型組進(jìn)行對(duì)照。電針組選取雙側(cè)“足三里”、“膈俞”及“百會(huì)”、“大椎”，針刺得氣后接通電針儀，采用疏密波，頻率2/80 Hz，每次治療10 min，連續(xù)15 d，觀察比較各組小鼠行為學(xué)與海馬SOD活性及MDA、NOS含量的變化。結(jié)果與假手術(shù)組比較，各模型組學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)均顯著下降(P<0.01)，海馬SOD活性均明顯降低(P<0.01)，MDA、NOS含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各電針組學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)均顯著提高(P<0.01)，海馬SOD活性均明顯升高(P<0.01)，MDA、NOS含量均顯著降低(P<0.01)，并且造模第3天治療效果優(yōu)于造模當(dāng)日(P<0.05或 P<0.01)。結(jié)論電針能夠提高VD小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，其作用機(jī)制與對(duì)抗腦缺血損傷后氧化損傷有關(guān)，并初步發(fā)現(xiàn)介入干預(yù)時(shí)間不同，其治療效應(yīng)存在差異。

〔關(guān)鍵詞〕血管性癡呆；超氧化物歧化酶(SOD)；丙二醛(MDA)；一氧化氮合酶(NOS)；電針

血管性癡呆(VD)是由腦血管疾病所致的智能及認(rèn)知障礙臨床綜合征，與腦血管疾病聯(lián)系密切〔1〕，其中以認(rèn)知功能障礙為核心表現(xiàn)〔2〕，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量。目前，隨著腦血管病發(fā)病的逐年升高，VD的防治已成為亟待解決的問(wèn)題〔3〕。研究表明，針刺治療本病安全，不僅可以有效改善認(rèn)知功能，還能夠改善整體功能〔4,5〕。但對(duì)具有臨床指導(dǎo)意義的效應(yīng)規(guī)律研究尚存不足，尤其是腦缺血后有關(guān)針刺介入時(shí)間與干預(yù)效應(yīng)方面的研究。本研究通過(guò)對(duì)缺血再灌注VD模型小鼠進(jìn)行電針干預(yù)，并于造模當(dāng)日和造模第3天作為介入時(shí)間點(diǎn)，觀察并比較其對(duì)VD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力及海馬超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)、一氧化氮合酶(NOS)含量的影響，初步探討電針治療本病的作用機(jī)制和針灸介入治療較理想的干預(yù)時(shí)機(jī)，以期為臨床尋求理想治療方法和治療時(shí)機(jī)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1材料與方法

1.1動(dòng)物與分組選用健康雄性昆明小鼠60只，體質(zhì)量28~32 g，由河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(昆明小鼠二級(jí)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，合格證號(hào)：612159)。將其隨機(jī)分為兩批，每批各設(shè)假手術(shù)組、模型組、電針組，每組10只。恒溫單籠飼養(yǎng)，自然進(jìn)食水。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的處理方法均經(jīng)河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。

1.2試劑與儀器試劑：MDA、SOD、NOS試劑盒(南京建成生物工程研究所)；總蛋白測(cè)定試劑盒(保定長(zhǎng)城試劑有限公司)。儀器：華佗牌針灸針(蘇州醫(yī)療用品廠)、韓氏電針儀WQ1002F型(北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)公司)、小鼠跳臺(tái)儀(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)、MSE-25型高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；TDL-5-A型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)；HH-W21-600型電熱恒溫水箱(天津市泰斯特儀器有限公司)；FA2004型上皿電子天平(上海精科天平儀器廠)；722型光柵分光光度計(jì)(上海第三分析儀器廠)；GL-88B型旋渦混勻器(江蘇海門(mén)其林醫(yī)用儀器廠)。

1.3模型復(fù)制造模方法參照文獻(xiàn)〔6〕。將小鼠用10%水合氯醛0.35 g/kg經(jīng)腹腔注射麻醉，頸部正中常規(guī)消毒后切口，分離出雙側(cè)頸總動(dòng)脈，套“4”號(hào)絲線扣并拉緊，阻斷血流20 min，同時(shí)在距離尾尖1 cm處剪斷放血約0.3 ml，熱凝止血。松開(kāi)絲扣，使血液灌注10 min，再次阻斷血流20 min。第2次再灌后觀察30 min，縫合皮膚。假手術(shù)組分離出頸總動(dòng)脈，穿線但不結(jié)扎，尾部也不放血，觀察時(shí)間與其他組相同。術(shù)后每日肌注青霉素0.2萬(wàn)U，連續(xù)3 d。術(shù)中維持小鼠肛溫(36±0.5)℃，防止低溫對(duì)缺血所致腦損傷的保護(hù)作用。

1.4針刺方法第1批小鼠于造模當(dāng)天蘇醒后開(kāi)始電針干預(yù)；第2批小鼠于造模第3天開(kāi)始電針干預(yù)。電針組：將小鼠固定于自制束鼠器上，參照《中國(guó)獸醫(yī)針灸學(xué)》〔7〕，選取“百會(huì)”、“大椎”、“足三里”(雙側(cè))、“膈俞”(雙側(cè))，選用0.35 mm×13 mm毫針，常規(guī)消毒，針刺得氣后，接韓氏電針儀，采用疏密波，頻率2/80 Hz，強(qiáng)度以小鼠肢體輕微顫動(dòng)，但不掙扎嘶叫為度(約2.0 mA)，每次治療10 min，1次/d，連續(xù)15 d。模型組和假手術(shù)組：將小鼠固定于自制束鼠器上10 min，但不施加電針干預(yù)，1次/d，連續(xù)15 d。

1.5觀察指標(biāo)及檢測(cè)方法

1.5.1行為學(xué)檢測(cè)治療結(jié)束后采用跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行行為學(xué)測(cè)試。先將小鼠置于跳臺(tái)儀中，適應(yīng)環(huán)境3 min，然后底部銅柵通以36 V交流電，記錄小鼠受到電刺激后跳上橡皮墊的反應(yīng)時(shí)間和5 min內(nèi)受電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為學(xué)習(xí)成績(jī)。24 h后將小鼠置于跳臺(tái)儀中適應(yīng)3 min，再將其置于橡皮墊上，記錄第一次跳下橡皮墊所需時(shí)間(潛伏期)和5 min內(nèi)受電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))，作為記憶成績(jī)。

1.5.2海馬SOD活性及MDA、NOS含量測(cè)定跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后麻醉下斷頭處死小鼠，根據(jù)小鼠腦立體定位圖〔8〕，冰盤(pán)上快速剖取全腦，棄去嗅球及小腦。取小鼠右側(cè)海馬組織稱(chēng)重后加入預(yù)冷的生理鹽水，用電動(dòng)勻漿器研磨，鏡檢未見(jiàn)完整細(xì)胞，制成10%組織勻漿，4℃，3 600 r/min，離心5 min后提取上清液備用。采用黃嘌呤氧化酶法測(cè)定SOD活性，硫代巴比妥酸(TBA)比色分析法測(cè)定MDA含量，分光光度法測(cè)定NOS含量(所有實(shí)驗(yàn)指標(biāo)由河北醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心檢測(cè))。

2結(jié)果

2.1各組小鼠行為學(xué)檢測(cè)兩批模型組小鼠的反應(yīng)時(shí)間均延長(zhǎng)，潛伏期均縮短，錯(cuò)誤次數(shù)均增加(P<0.01)，表明造模成功；兩批電針組小鼠反應(yīng)時(shí)間均縮短，潛伏期均延長(zhǎng)，錯(cuò)誤次數(shù)均明顯降低，與同批模型組比較有顯著差異(P<0.01)；且兩批電針組之間比較有差異，造模第3天電針組記憶成績(jī)優(yōu)于造模當(dāng)天組(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表1,表2。

表1　各組小鼠跳臺(tái)學(xué)習(xí)成績(jī)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

表2　各組小鼠跳臺(tái)記憶成績(jī)比較

與假手術(shù)比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；與第1批比較:3)P<0.05，4)P<0.01

2.2各組小鼠海馬SOD活性及MDA、NOS含量測(cè)定與假手術(shù)組比較，各批模型組小鼠海馬SOD活性均明顯下降，MDA和NOS含量均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，各批電針組海馬SOD活性均明顯增高，MDA和NOS含量均顯著降低(P<0.01)，且兩批電針組之間比較有差異，造模第3天電針組改善優(yōu)于造模當(dāng)天組(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3　各組小鼠海馬SOD活性及MDA、NOS含量比較

與假手術(shù)組比較:1)P<0.01；與模型組比較:2)P<0.01；與第1批比較:3)P<0.05

3討論

研究證實(shí)，腦缺血再灌注可觸發(fā)腦組織中自由基的大量產(chǎn)生，過(guò)剩的自由基可使腦組織受損〔9〕，其可直接作用于生物膜磷脂引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化作用，導(dǎo)致膜功能障礙和膜酶損傷，進(jìn)而影響腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和攝取。同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化過(guò)程中生成的自由基又會(huì)對(duì)酶和細(xì)胞成分造成損傷，甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡〔10〕，引發(fā)智能與認(rèn)知障礙。MDA是脂質(zhì)過(guò)氧化物的分解產(chǎn)物，能夠交聯(lián)蛋白質(zhì)與核酸，使DNA發(fā)生突變，導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成能力下降或合成功能紊亂，同時(shí)，還可使自由基清除劑的關(guān)鍵酶SOD生成減少、活性降低。SOD可以延緩或防止生物物質(zhì)氧化，減輕自由基造成的損傷。其通過(guò)催化生物氧化產(chǎn)生超氧自由基，清除并阻止氧離子引發(fā)的自由基連鎖反應(yīng)，從而起到保護(hù)腦細(xì)胞的作用〔11〕。

一氧化氮(NO)是不配對(duì)電子自由基〔12〕，在體內(nèi)具有雙重作用，適量的NO可清除自由基，調(diào)節(jié)腦血流量，加強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶功能〔13〕；但NO相對(duì)過(guò)多時(shí)，則會(huì)與氧自由基相互作用生成毒性更強(qiáng)的過(guò)氧亞硝酸自由基(OONO-)，進(jìn)而影響腦功能的恢復(fù)〔14〕。NOS是NO產(chǎn)生的關(guān)鍵酶，其通過(guò)Ca2+通道而被激活，其作用于機(jī)體可合成大量NO，因此，NOS的表達(dá)水平，可直接反映細(xì)胞內(nèi)NO水平〔15〕。

研究證實(shí)，全腦缺血再灌注后6 h海馬區(qū)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)含量上升，但于1 d開(kāi)始回落，3 d已明顯低于對(duì)照組，5 d又回升并接近對(duì)照組〔16〕。病理觀察證實(shí)，重復(fù)缺血再灌注早期，神經(jīng)細(xì)胞間質(zhì)水腫、變性，海馬區(qū)無(wú)明顯改變；而再灌注3 d，海馬神經(jīng)凋亡百分率最高，此后隨再灌注時(shí)間延長(zhǎng)，海馬神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)逐漸下降〔17〕，而缺血再灌注后5 d神經(jīng)元明顯死亡，表現(xiàn)出典型的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡現(xiàn)象〔18,19〕。

以上研究表明，缺血再灌注3 d，海馬區(qū)單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)降低最為明顯，海馬神經(jīng)凋亡百分率最高，是機(jī)體處于相對(duì)明顯且可逆轉(zhuǎn)的缺血損傷狀態(tài)，筆者認(rèn)為，此時(shí)給予電針干預(yù)，可充分發(fā)揮針灸所具有的雙向良性調(diào)整作用；缺血當(dāng)天，機(jī)體內(nèi)環(huán)境處于相對(duì)紊亂狀態(tài)，病理改變尚不明顯，針灸的雙向作用難以充分發(fā)揮；缺血再灌注5 d以后，海馬神經(jīng)元明顯死亡，逆轉(zhuǎn)概率也會(huì)降低。故本研究設(shè)造模當(dāng)日和造模后3 d作為電針干預(yù)時(shí)間點(diǎn)，結(jié)果顯示，造模后3 d電針干預(yù)組療效優(yōu)于造模后當(dāng)日電針干預(yù)組。

VD屬于中醫(yī)“老年呆病”范疇。《本草綱目》曰“腦為元神之府”，《本草備要》也有“人之記性，皆在腦中”，故祖國(guó)醫(yī)學(xué)認(rèn)為，癡呆的病位在腦?！鹅`樞·調(diào)經(jīng)論》記載：“血并于上，氣并于下，亂而善忘?！薄峨s病源流犀燭·中風(fēng)》指出“有中風(fēng)后善忘”，故筆者認(rèn)為，VD的發(fā)生多與氣虛血瘀、瘀阻腦絡(luò)，以致腦髓失養(yǎng)，神明失常密切相關(guān)。督脈入屬于腦，百會(huì)、大椎可疏通督脈經(jīng)氣，使腦部氣血通暢，恢復(fù)元神之府之所主，《針灸大成》載：“百會(huì)主心煩悶，驚悸健忘，忘前失后，心神恍惚?！庇醒芯勘砻?，百會(huì)有明顯提高記憶力的作用〔20〕。膈俞乃血之會(huì)穴，有養(yǎng)血活血，祛瘀活絡(luò)之功；足三里健運(yùn)脾胃，既扶助正氣以推動(dòng)血行，又益氣生血以充養(yǎng)腦髓。四穴合用，益氣活血，醒腦益智，從而使“血脈和利，精神乃居”。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明電針能夠提高模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，改善缺血再灌注所致的認(rèn)知障礙，其作用機(jī)制可能與電針清除機(jī)體自由基，提高機(jī)體的抗氧化能力，保護(hù)受損的海馬組織有關(guān)，且可能存在一定的時(shí)效關(guān)系。

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〔2014-09-17修回〕

(編輯趙慧玲/曹夢(mèng)園)

〔中圖分類(lèi)號(hào)〕R245.9

〔文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼〕A

〔文章編號(hào)〕1005-9202(2016)07-1549-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.006

通訊作者：張會(huì)珍 (1962-)，女，碩士生導(dǎo)師，教授，主要從事針灸防治心腦血管病研究。

基金項(xiàng)目：河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.H2013206245)；河北省中醫(yī)藥管理局計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2004010)；河北省中醫(yī)藥管理局計(jì)劃項(xiàng)目(No. 05155)

1河北醫(yī)科大學(xué)研究生

馬小順(1971-)，男，副教授，主要從事經(jīng)穴特異性研究。

第一作者：孫彥輝(1971-)，男，博士，副教授，主要從事針灸臨床與作用機(jī)制的研究。