趙丹玉　苗蘭英　曹　陽　王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧　沈陽　110847)

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眼針對腦缺血再灌注損傷模型大鼠腦皮層組織TLR4、MyD88表達(dá)的影響

趙丹玉苗蘭英曹陽王德山

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，遼寧沈陽110847)

〔摘要〕目的探討眼針治療腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型大鼠腦皮層組織中Toll樣受體4(TLR4)及髓樣分化因子88(MyD88)的作用機(jī)制。方法健康雄性SPF級Wistar雄性大鼠60只，隨機(jī)分為正常組、假手術(shù)組、CIRI模型組和眼針組。CIRI模型組和眼針組采用改良的線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MACO)動物模型。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-1β水平，Western 印跡檢測大鼠缺血側(cè)腦皮層TLR4、MyD88蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果與正常組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清IL-1β水平明顯升高(P<0.01)，缺血側(cè)腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白水平均顯示高表達(dá)(P<0.01)；眼針組同模型組相比，血清IL-1β水平顯著下降(P<0.01)，缺血側(cè)腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。結(jié)論眼針抑制腦皮層組織中TLR4、MyD88的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)，可能是眼針治療CIRI的主要作用機(jī)制之一。

〔關(guān)鍵詞〕眼針；腦缺血再灌注；TLR4；MyD88

眼針療法是在眼眶周圍進(jìn)行針刺防治疾病的一種微針療法，其理論基礎(chǔ)是眼通過經(jīng)絡(luò)系統(tǒng)與臟腑密切相連。臨床上根據(jù)不同臟腑、器官的病變和病位選取相應(yīng)的穴位進(jìn)行針刺，從而達(dá)到治療全身不同部位疾病的目的。多年的臨床實踐證明，本療法對于急性腦缺血性疾病具有很好的療效，然而眼針治療腦缺血性疾病的作用機(jī)制尚亟待研究闡明。本課題建立大鼠腦缺血再灌注損傷(CIRI)模型，觀察眼針對大鼠血清白細(xì)胞介素(IL)-1β水平及損傷側(cè)腦皮質(zhì)Toll樣受體4(TLR4)和髓樣分化因子88(MyD88)蛋白表達(dá)的影響，研究眼針對CIRI的作用機(jī)制,為“眼絡(luò)于腦”的中醫(yī)理論假說提供實驗依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料健康雄性SPF級Wistar雄性大鼠60只，體重280~320 g。購自上海西普爾必凱實驗動物有限公司，動物許可證號：SCXK(滬)2008-0016。IL-1β ELISA試劑盒、一抗GAPDH、TLR4及MyD88多克隆抗體、羊抗兔IgG購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2動物分組與模型復(fù)制60只大鼠以隨機(jī)數(shù)字法分為正常組、假手術(shù)組、模型組和眼針組，剔除造模不成功以及死亡鼠，最終每組均為12只。

正常組：常規(guī)喂養(yǎng)無任何施加因素。模型復(fù)制與成模標(biāo)準(zhǔn)：采用改良的線栓法建立大鼠大腦中動脈缺血再灌注(MACO)動物模型(右側(cè)栓塞)〔1〕。造模后參照Longa 5分制評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分〔2〕。神經(jīng)功能缺損評分≥1分視為造模成功。將造模成功的大鼠再隨機(jī)分為模型組和眼針組。假手術(shù)組：術(shù)式與操作基本過程同模型組和眼針組，只是不進(jìn)行大腦中動脈栓塞。模型組常規(guī)喂養(yǎng)，不給予任何刺激。眼針組在缺血再灌注即刻、造模術(shù)后12、24 h(即處死前)各進(jìn)行眼針1次。

1.3眼針取穴與刺法參照人體取穴定位法分別取上焦區(qū)、下焦區(qū)、肝區(qū)、腎區(qū)；刺法：用35×25 mm毫針在相應(yīng)眼穴區(qū)距眶內(nèi)緣2 mm處，平刺，由該區(qū)始點向該區(qū)終點方向，刺入0.3 cm，行捻轉(zhuǎn)手法，留針30 min，15 min行針1次，時間1 min。

1.4血清IL-1β含量的測定各組大鼠CIRI術(shù)后24 h麻醉后腹主動脈取血，分離血清后按照武漢博士德生物工程公司IL-1β的ELISA試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5Western 印跡檢測TLR4及MyD88蛋白表達(dá)于造模術(shù)后24 h每組各取6只鼠，麻醉后,迅速斷頭取腦，于無菌條件下冰上分離右側(cè)皮層組織，加入相應(yīng)體積的裂解液后勻漿， 12 000 r/min離心30 min，收集上清，檢測各樣本蛋白濃度。將樣品和蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)分別加入膠孔內(nèi)開始電泳。電泳完畢，半干式轉(zhuǎn)印槽印跡約1.5 h，封閉，37℃，2 h，加入適當(dāng)稀釋的一抗(TLR4、MyD88、GAPDH均以1∶100用封閉液稀釋)，4℃過夜。TBST沖洗后加入1∶2 000稀釋的酶標(biāo)二抗，37℃，45 min。DAB顯色。掃描硝酸纖維素膜上的條帶，凝膠掃描系統(tǒng)進(jìn)行吸光度積分分析(IOD)，以GAPDH作為內(nèi)參，各組TLR4、MyD88的蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD和內(nèi)參GAPDH的蛋白表達(dá)強(qiáng)度IOD比值顯示各組TLR4、MyD88的蛋白表達(dá)。

2結(jié)果

2.1眼針對CIRI 模型大鼠一般狀態(tài)影響正常組及假手術(shù)組大鼠無神經(jīng)功能缺損體征出現(xiàn)，根據(jù)神經(jīng)功能缺損評分標(biāo)準(zhǔn)評分均為0分。模型組及眼針組大鼠術(shù)中死亡7只，另外有5只大鼠神經(jīng)功能缺損不明顯，即將造模成功的大鼠隨機(jī)分為模型組和眼針組各12只。造模成功的大鼠蘇醒后出現(xiàn)明顯的不能完全伸展對側(cè)前爪、向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈及向?qū)?cè)傾倒等神經(jīng)功能缺損癥狀。術(shù)后24 h,模型組動物神經(jīng)功能缺損癥狀隨時間延長逐漸加重，神經(jīng)功能缺損評分具有明顯的上升趨勢；眼針組神經(jīng)功能缺損癥狀加重不明顯，顯示出眼針治療的腦保護(hù)作用。

2.2眼針對CIRI模型大鼠血清IL-1β含量的影響假手術(shù)組〔(44.04±4.47)μg/mg〕同正常組〔(45.30±4.10)μg/mg〕比較，血清中IL-1β含量沒有明顯差異(P>0.05)。模型組血清中IL-1β含量〔(83.94±5.15)μg/mg〕顯著升高(P<0.01)；眼針組血清中IL-1β含量〔(61.13±3.43)μg/mg〕明顯下降(P<0.01)。

2.3眼針對CIRI模型大鼠大腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白表達(dá)影響如圖1、表1所示，正常組及假手術(shù)組大鼠右側(cè)大腦皮層組織TLR4、MyD88蛋白均表達(dá)較少，二者之間沒有顯著差異(P>0.05)；與正常組與假手術(shù)組相比較，CIRI模型組TLR4、MyD88均呈現(xiàn)明顯高表達(dá)(P<0.01)；而眼針組表達(dá)較模型組明顯下降(P<0.05)。

圖1　TLR4、MyD88蛋白印跡

表1　各組TLR4、MyD88蛋白表達(dá)水平比較

與正常組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01

3討論

TLR4是Toll樣受體(TLR)家族的成員之一，屬于I型跨膜受體蛋白。其胞外區(qū)負(fù)責(zé)識別病原菌或內(nèi)源性配體；胞內(nèi)區(qū)具有TIR結(jié)構(gòu)域，主要作用是介導(dǎo)細(xì)胞應(yīng)答的信號啟動，參與炎癥反應(yīng)或炎癥病理反應(yīng)。MyD88屬于TLR家族和死亡結(jié)構(gòu)域家族成員，其羧基端具有TIR結(jié)構(gòu)域，可以同TLR4的TIR結(jié)構(gòu)域結(jié)合；氨基端具有死亡結(jié)構(gòu)域(DD)，可以募集細(xì)胞內(nèi)的IL-1受體相關(guān)激酶(IRAK)并使其磷酸化。TLR4作為膜結(jié)合蛋白，當(dāng)與配體結(jié)合后，其胞內(nèi)的TIR結(jié)構(gòu)域連接胞內(nèi)銜接蛋白MyD88，進(jìn)而啟動下游IRAK磷酸化，繼而激活腫瘤壞死因子(TNF)受體相關(guān)因子(TRAF)〔3~6〕，激活核因子(NF)-κB，促進(jìn)多種細(xì)胞因子及炎癥因子的表達(dá)，啟動炎癥反應(yīng)〔7，8〕。此為MyD88依賴的TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

CIRI的病理生理是一個多環(huán)節(jié)、多因素、多途徑損傷的級聯(lián)反應(yīng)過程〔9〕，其發(fā)病機(jī)制目前也沒有完全研究清楚，但是已證實，腦缺血再灌注時的炎癥反應(yīng)促進(jìn)了繼發(fā)性腦損害,是CIRI的主要原因之一〔10〕。已有大量的研究表明，TLR4與CIRI密切相關(guān)〔11，12〕。本課題的前期研究以及對于血清IL-1水平的檢測均證明了CIRI時炎癥反應(yīng)明顯加強(qiáng)。模型組大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織TLR4蛋白表達(dá)明顯增高〔13〕，同以往的研究結(jié)果一致。結(jié)合本實驗對于模型組大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織MyD88蛋白表達(dá)的檢測結(jié)果，CIRI時有可能由于某些內(nèi)源性炎癥介質(zhì)的釋放促進(jìn)了TLR4的表達(dá)，極有可能激活了TLR4介導(dǎo)的MyD88依賴的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而使NF-κB活化，啟動TNF-α、IL-1β等炎癥因子的轉(zhuǎn)錄，加重了CIRI時炎癥反應(yīng)。而眼針組大鼠缺血側(cè)大腦皮層組織TLR4及MyD88的蛋白表達(dá)均顯著降低。說明眼針刺激能夠抑制TLR4及MyD88的表達(dá)，進(jìn)而抑制其下游蛋白的活化，抑制NF-κB與炎癥因子的結(jié)構(gòu)基因上游的調(diào)控序列結(jié)合，抑制炎癥因子的表達(dá)而減輕其炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到對腦皮層組織的保護(hù)目的，這可能是眼針對于CIRI有顯著療效的機(jī)制之一。至于MyD88表達(dá)的下調(diào)是TLR4表達(dá)下調(diào)后的結(jié)果還是眼針刺激的調(diào)節(jié)靶點，還有待于今后作進(jìn)一步的研究。

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〔2013-07-30修回〕

(編輯曲莉)

Influences of eye acupuncture on the expression of IKKβ/NF-κB in rat's brain after acute cerebral ischemia/reperfusion

ZHAO Dan-Yu,MIAO Lan-Ying,CAO Yang,etal.

College of Basic Medical,Liaoning University of Traditional Chinese Medicine,Shenyang 110847,Liaoning,China

【Abstract】ObjectiveTo evaluate the expressions of TLR4 and MyD88 in cerebral ischemia-reperfusion injury(CIRI) in rat brain cortex and the effect of eye acupuncture.MethodsAdult male SPF Wistar male rats were randomly divided into normal,sham operation,CIRI model and eye acupuncture groups.The model of middle cerebral artery occlusion(MACO) was established by the improved suture method.ELISA method was performed to determine the IL-1β level,Western blot was performed to examine the protein expressions of TLR4 and MyD88 in the ischemic brain cortex.ResultsThe IL-1β level and protein expressions of TLR4 and MyD88 in CIRI model group were increased significantly ( P< 0.01) compared with those in normal and sham operation groups,and which were decreased significantly (P<0.01) in eye acupuncture group.ConclusionsEye acupuncture therapy could reduce the IL-1β level and expressions of TLR4 and MyD88 in CIRI ,which might be the treatment mechanism of eye acupuncture therapy on CIRI rat .

【Key words】Eye acupuncture; Cerebral ischemia and reperfusion;TLR4;MyD88

〔中圖分類號〕R28516

〔文獻(xiàn)標(biāo)識碼〕A

〔文章編號〕1005-9202(2016)07-1547-03；

doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.07.005

通訊作者：王德山(1951-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事中醫(yī)藥對消化道神經(jīng)內(nèi)分泌影響機(jī)制的研究。

基金項目：國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃(973計劃)(No.2007CB512700)；遼寧省教育廳課題(No.L2010349)

第一作者：趙丹玉(1978-)，女，博士，副教授，主要從事中醫(yī)藥對受體及受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響機(jī)制的研究。