曾偉權(quán) （廣東省博羅縣福田畜牧獸醫(yī)站 516131）

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奶牛支原體性乳房炎病原的分離鑒定

曾偉權(quán) （廣東省博羅縣福田畜牧獸醫(yī)站 516131）

摘要本文從有乳房炎臨床癥狀的奶牛中采集牛奶樣本，經(jīng)細菌培養(yǎng)和支原體培養(yǎng)、通過菌落形態(tài)觀察、生化試驗、特異性PCR鑒定和16SrRNA測序比對對分離株進行鑒定，證實為牛支原體感染，同時還有其他細菌的混合感染。

關(guān)鍵詞奶牛 支原體 感染 乳房炎

牛支原體(Mycoplasma bovis)作為感染牛的一種重要的致病性支原體，可以引起包括肺炎、乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道損傷以及結(jié)膜炎等在內(nèi)的多種疾病，同時還可與其他病原協(xié)同，造成繼發(fā)感染。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 內(nèi)蒙古某地奶牛場無菌采集并送檢的患病奶牛的乳樣14份。

1.1.2 培養(yǎng)基 培養(yǎng)基為PPLO液體培養(yǎng)基，配方為：

PPLO 2.1g/100ml、D-Glucose 0.1g/100ml、酚紅250μl/ 100ml、酵母浸出液1ml/100ml(300ml/L)、滅活馬血清

20ml/100mi、青霉素(200UI/ml)、葡萄糖(4g/L)、丙酮酸鈉(2g/L)，用1mol/L NaOH調(diào)pH至7.6～7.8，置4℃保存?zhèn)溆肹1]。

1.1.3 儀器設(shè)備 37℃溫箱、顯微鏡、冰箱(4℃、20℃)、

PCR儀、離心機、水浴鍋、電泳儀、低溫臺式高速離心機為SIGMAD公司產(chǎn)品；YY2Ⅲ-8B穩(wěn)壓穩(wěn)流型電泳儀為北京六一儀器廠產(chǎn)品；PTC200、PCR儀為BIO-RAD公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.1.4 主要試劑 革蘭氏染色液、瑞氏染色有、姬姆薩染色液、葡萄糖生化鑒定管、精氨酸生化鑒定管、四氮唑生化鑒定管等。

1.2 方法

1.2.1 細菌的分離培養(yǎng) 將送檢的奶樣用高壓滅菌后的棉簽蘸取劃線涂抹于伊紅美蘭平板培養(yǎng)基、高鹽甘露醇平板培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基和普通瓊脂平板培養(yǎng)基，培養(yǎng)皿倒置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24h。觀察培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上劃線處長出的菌落形態(tài)，用接種環(huán)輕輕刮取不同菌落形態(tài)的細菌，革蘭氏和美蘭染色油鏡下觀察細菌形態(tài)，同時刮取少量細菌按同樣的方法再次涂于普通瓊脂培養(yǎng)基進行純培養(yǎng)。

1.2.2 牛支原體的培養(yǎng) 吸取1ml奶樣經(jīng)濾膜過濾加入到

PPLO液體培養(yǎng)基中，同時用高壓滅菌后的棉棒蘸取送檢奶樣均勻涂于PPLO固體培養(yǎng)基表面，一起放入盛有蠟燭的滅菌干燥缸內(nèi)，平板用封口膜封好并倒置，點燃蠟燭蓋嚴干燥缸，待蠟燭熄滅后放置于37恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)3～5d后，在倒置光學顯微鏡下觀察菌落形態(tài)。挑取單個菌落克隆接種液體培養(yǎng)基，待生長后再接種固體培養(yǎng)基，至少3次克隆純化后，將菌種凍存，保存于-80℃。支原體液體培養(yǎng)基由紅色變?yōu)辄S色，并且清亮；固體培養(yǎng)基上的菌落呈油滴狀、發(fā)暗、沒有暈圈，經(jīng)傳代培養(yǎng)后，菌落會呈現(xiàn)出典型的“油煎蛋”樣外觀。

1.2.3 涂片鏡檢 （1）革蘭氏染色：將涂片在火焰上固定，滴加結(jié)晶紫染色液，染1min，水洗。滴加革蘭氏典液，作用1min，水洗。滴加脫色酒精，約30s。結(jié)果：革蘭氏陽性呈紫色；革蘭氏陰性呈紅色。（2）姬姆薩染色：于5ml新煮過的中性蒸餾水中滴加5～10滴姬姆薩染液原液，即稀釋為常用的姬姆薩染液；抹片甲醇固定并干燥后，在其上滴加足量染色液或抹片浸入盛有染色液的染缸中，染色30min，取出水洗，吸干，鏡檢。細菌呈藍青色，組織細胞胞漿呈紅色，細胞核呈藍色。牛支原體呈淡紫色。（3）瑞氏染色：取病料涂片、自然干燥，滴加瑞氏染液染3min，使標本被其中甲醛所固定；加等量pH6.4的磷酸鹽緩沖液輕輕晃動玻片，均勻靜置5min；水洗、吸干、鏡檢。細菌染成藍色，組織細胞胞漿紅色，細胞核藍色。牛支原體呈淡紫色。

1.2.4 牛支原體生化鑒定 將分離純化的細菌增菌后進行發(fā)酵葡萄糖、水解精氨酸試驗、水解尿素試驗、四氮唑還原試驗、需要膽固醇試驗。（1）發(fā)酵葡萄糖和水解精氨酸試驗：將待檢支原體接種于支原體液體培養(yǎng)基中，內(nèi)含0.5%葡萄糖或0.2%精氨酸，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。同時設(shè)置陰、陽性對照組。（2）水解尿素試驗：支原體培養(yǎng)基中不加葡萄糖和精氨酸而加入0.1%尿素，調(diào)pH至5.5～6.0，接種待檢支原體后最終pH上升，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。同時設(shè)置陰、陽性對照組。（3）四氮唑還原試驗：氯化四氮唑1g，蒸餾水50ml 溶解后用除菌過濾器過濾除菌待用。配制支原體培養(yǎng)基不加葡萄糖精氨酸和酚紅而加入0.02%氯化四氮唑，調(diào)pH到7.0～7.2.接種待測支原體培養(yǎng)，37℃溫箱培養(yǎng)2周，觀察培養(yǎng)基的顏色變化。同時設(shè)置陰、陽性對照組。（4）需要膽固醇試驗：取支原體的培養(yǎng)基兩管，其中一個加馬血清，另一個不加馬血清。然后在兩管中分別平行接種待測支原體的培養(yǎng)物。觀察來那個兩管中的支原體的長狀態(tài)確定此次分離的菌株生長是否需要膽固醇。

1.2.5 牛支原體PCR的鑒定 使用北京全式金生物技術(shù)有限公司的支原體基因組DNA抽提試劑盒提純培養(yǎng)物基因組DNA。利用牛支原體特異性引物P1: 5`－TTTTAGCTCT TTTGAACAAAT－3`，P2: 5`－GGCTCTCATTAAGAATG TC－3`。

1.2.6 16S rRNA序列測序與分析 根據(jù)已發(fā)表文獻[2]報道的方法擴增支原體培養(yǎng)物16SrRNA基因序列，預計擴增片段長度為238pb。將PCR擴增產(chǎn)物連接到T載體中送去南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司進行測序，利用BLAST軟件將測序結(jié)果與部分支原體菌株的16SrRNA序列進行比對分析。

1.2.7 牛支原體藥物敏感性試驗 采用紙片擴散法[3]，即在“超凈臺”中用吸管滴加純培養(yǎng)菌液1滴(約0.02ml)于鮮血瓊脂平板上，用L棒將菌液均勻涂布，加蓋后放置10min左右，待平板面稍干，將鑷子于酒精燈火焰滅菌后略停，取藥敏紙片平放在瓊脂平板上，并輕壓使其緊貼平板表面，藥敏紙片一旦接觸平板即不再移動，每種藥敏片的名稱在平皿背面做好標記。將貼好紙片的平板置于37℃溫箱中置于5%CO2培養(yǎng)2～3d，2～3d后觀察并測量抑菌圈直徑(包括藥敏紙片直徑)，并與標準抑菌環(huán)直徑相比較，得出結(jié)論。此次藥敏試驗選用的藥敏片有：左氧氟沙星，環(huán)丙沙星，恩諾沙星，氧氟沙星，紅霉素，鏈霉素，卡那霉素，慶大霉素。

表1　藥敏實驗參考標準 (mm)

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)病牛的臨床癥狀

自2012年11月起內(nèi)蒙古某奶牛場相繼出現(xiàn)高產(chǎn)奶牛感染乳房炎，患牛乳區(qū)發(fā)熱、乳房紅腫(圖4)；患牛乳汁呈粘稠狀、絮狀、膿汁甚至血乳；患牛精神沉郁、食欲減退；其中一頭牛蹄部腫脹，出現(xiàn)跛行。

2.2 細菌分離鑒定結(jié)果

從送檢的奶樣中分別分離到形狀為短桿狀排列分散的細菌、短桿狀呈簇狀排列的短桿菌、圓形球菌和圓形小球菌，染色鏡檢后，根據(jù)菌體形態(tài)及染色特性初步判定這些細菌分別為大腸桿菌、克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌和支原體。

2.3 支原體分離結(jié)果

在液體培養(yǎng)基中盲傳2代后，3份樣品的培養(yǎng)基顏色開始變黃，呈輕微混濁狀。將培養(yǎng)物純化，獲得3份純培養(yǎng)物。將純培養(yǎng)物接種于固體培養(yǎng)基上，72h后可以觀察到乳白色、針尖狀大小的菌落，倒置低倍普通光學顯微鏡下可看到菌落呈圓形，邊緣整齊，具有典型的“油煎蛋狀”形態(tài)，如圖1。

2.4 鏡檢結(jié)果

2.4.1 革蘭氏染色 革蘭氏染色呈陰性，見圖2。

圖1　牛支原體“油煎蛋”樣外觀

圖2　革蘭氏染色

2.4.2 姬姆薩染色 干燥后用800～1000倍顯微鏡觀察。呈淡紫色，菌為多形態(tài)，以球點狀最常見。結(jié)果見圖3。2.4.3 瑞氏染色 干燥后用顯微鏡觀察，呈淡紫色，見圖4。

圖3　姬姆薩染色

圖4　瑞氏染色

2.5 牛支原體生化鑒定

四氮唑還原試驗反應管呈紅色，與陽性對照相同，所以判定為陽性。加葡萄糖的、甘露醇、精氨酸的培養(yǎng)支原體反應管均不變色，與陰性對照相同，所以判定為陰性。培養(yǎng)基中加尿素的反應管不變色，仍然呈黃色，與陰性對照相同，所以判定為陰性。在加了血清的培養(yǎng)基成長良好，證明此次分離的支原體的生長需要血清中膽固醇。這些生化反應與己報道牛支原體生化特性相符，因此從牧場分離的支原體為牛支原體。

表2　生化反應結(jié)果

2.6 PCR鑒定

用滅菌鑷子夾取高壓滅菌后10μl槍頭從固體平皿上挑取已純化后的支原體菌落加入盛有150μl滅菌水的Eppendorf管中，煮沸5min，冰浴1min，12000r/min離心30s，取上清作為DNA模板，同時直接將傳代培養(yǎng)的菌液作為模板。利用16S rRNA通用引物進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物克隆至質(zhì)粒pMD18-T(寶生物工程大連有限公司)中，委托上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司進行序列測定。

圖5　分離物的PCR 擴增結(jié)果

2.7 16 S rRNA基因序列分析

對16S rRNA擴增產(chǎn)物進行測序分析，利用BLAST軟件進行序列同源性比較，結(jié)果表明所分離支原體為牛支原體(Mycoplasma bovis)。

圖6　GT-01和 CT-02分離株16S rRNA基因序列的同源性分析

2.8 牛支原體藥物敏感性試驗

支原體沒有細胞壁結(jié)構(gòu)，對所有β內(nèi)酰胺類、糖肽類等抗生素固有耐藥性，大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類藥物對其有抑制作用。支原體對藥物的敏感性常用最低抑菌濃度(MIC)表示，本試驗選擇大環(huán)內(nèi)酯類、喹諾酮類藥物對牛支原體的最低抑菌濃度進行初步測定，結(jié)果表明牛支原體對紅霉素的耐藥性最低，其次是恩諾沙星、諾氟沙星，對環(huán)丙沙星的耐藥性最高，因此牛支原體性乳房炎的首選藥物為吡喹酮類藥物，以提高臨床治療效果[15]。

表3　藥敏實驗結(jié)果

3 討論

（1）在牛支原體乳腺炎的診斷方面，對其進行確診仍然需要進行病原體的分離鑒定及核酸診斷。牛支原體的分離培養(yǎng)鑒定雖然能夠確診，但操作復雜，所需條件高；生理生化特性檢查，包括葡萄糖發(fā)酵試驗和精氨酸水解試驗、尿素水解試驗，血清學鑒定也可以作為牛支原體的輔助診斷方法[4]。PCR方法有較高的特異性和靈敏性，且鑒定結(jié)果與生理生化方法鑒定結(jié)果的符合率為100%，顯示了較高的特異性、敏感性及符合率。PCR方法不僅提高了檢測的準確性，還縮短了鑒定時間，具有廣泛的應用前景，故該方法為乳房炎病原菌的快速鑒定提供依據(jù)和方便。（2）牛支原體對大部分抗生素不敏感，大部分在體外藥敏試驗結(jié)果中表現(xiàn)敏感的藥物，在支原體乳房炎臨床治療時卻不能產(chǎn)生良好的效果，有研究者認為這可能與奶牛血乳屏障阻礙藥物進入乳腺有關(guān)[5]。另據(jù)報道中西藥結(jié)合治療牛支原體乳房效果好，中藥用瓜蔞散加味，西藥用四環(huán)素、紅霉素、土霉素以及卡那霉素等四環(huán)素類抗生素進行治療[7]。在積極治療原發(fā)病的同時，也應采取相應的對癥治療措施，如發(fā)熱的?？捎冒材私?、復方氨基比林等解熱藥；體質(zhì)弱的牛補充能量和維生素C、復合維生素B、ATP等，亦結(jié)合樟腦注射液等進行強心治療。（3）分離株與牛支原體標準株的同源性為99.6%，進一步從基因序列水平上證實了分離株為牛支原體。（4）從送檢的奶樣中分離到支原體的同時，也少量分離到大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、鏈球菌等，這可能是因為支原體感染后的繼發(fā)感染。牛支原體病是嚴重危害養(yǎng)牛業(yè)的傳染性疾病，深入開展牛支原體致病機制、免疫原性等方面的研究，開發(fā)高效的牛支原體相關(guān)診斷試劑，從而有效防控牛支原體乳房炎，以促進我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)健康快速發(fā)展。

參考文獻

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收稿日期：（2015–10–15）

中圖分類號：S858.23

文獻標識碼：A

文章編號：1007-1733(2016)03-0001-03