李濤

(曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤科，云南 曲靖　655000)

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小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)人膀胱癌細(xì)胞BIU-87凋亡作用的機(jī)制探討

李濤

(曲靖市第一人民醫(yī)院腫瘤科，云南 曲靖655000)

摘要目的：研究小白菊內(nèi)酯對人膀胱癌細(xì)胞BIU-87增殖與凋亡的影響及其機(jī)制。方法：采用不同濃度(15、30、60 μmol·L(-1))小白菊內(nèi)酯孵育人膀胱癌細(xì)胞BIU-87后，用MTT法檢測小白菊內(nèi)酯對BIU-87細(xì)胞的增殖影響，流式細(xì)胞術(shù)檢測小白菊內(nèi)酯對BIU-87細(xì)胞凋亡率的影響，RT-PCR檢測小白菊內(nèi)酯作用BIU-87細(xì)胞后的bcl-2、bax mRNA表達(dá)情況。結(jié)果：經(jīng)小白菊內(nèi)酯作用后，MTT結(jié)果顯示BIU-87細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果表明BIU-87細(xì)胞凋亡率顯著上升(P<0.05)，RT-PCR結(jié)果表明BIU-87細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)、bax mRNA表達(dá)水平增高(P<0.05)。結(jié)論：小白菊內(nèi)酯通過誘導(dǎo)凋亡能抑制人膀胱癌細(xì)胞BIU-87的增殖，其機(jī)制可能與其下調(diào)bcl-2 mRNA和上調(diào)bax mRNA表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：小白菊內(nèi)酯；BIU-87細(xì)胞；凋亡；Bcl-2；Bax

膀胱癌是我國泌尿系統(tǒng)發(fā)病率最高的腫瘤[1]，近10年來，伴隨煙草消費(fèi)、工業(yè)化水平增加及人口老齡化，中國人膀胱癌發(fā)病率不論是男性還是女性，也不論在城市或農(nóng)村，均呈現(xiàn)逐年增長趨勢[2]。目前該病治療以手術(shù)和化療為主，但研究表明單純手術(shù)切除后，膀胱癌復(fù)發(fā)率高達(dá)57%~75%，而化療藥物對膀胱癌細(xì)胞靶向殺傷性不強(qiáng)，毒副作用大，且容易產(chǎn)生不同程度的多藥耐藥(Multidrug resistance，MDR)[3]。小白菊內(nèi)酯(Parthenolide，PN)是倍半萜烯內(nèi)酯的主要成分，傳統(tǒng)上主要用來治療偏頭痛、發(fā)熱和類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[4]。近年來研究發(fā)現(xiàn)小白菊內(nèi)酯可通過多種機(jī)制對多種腫瘤發(fā)揮抗癌重要作用，成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)之一[5]。本文通過研究不同濃度小白菊內(nèi)酯作用人膀胱癌BIU-87細(xì)胞株后對細(xì)胞增殖、凋亡產(chǎn)生的影響和BIU-87細(xì)胞bcl-2、bax mRNA表達(dá)水平的變化，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1材料

BIU-87細(xì)胞株(中科院上海細(xì)胞生物研究所)，小白菊內(nèi)酯、MTT試劑、二甲基亞砜(美國Sigma公司)，細(xì)胞培養(yǎng)基RPMI1640、胎牛血清(美國HyClone公司)，酶標(biāo)儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)，V-FITC凋亡檢測試劑盒(上海碧云天研究所)，流式細(xì)胞儀(美國Couler公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)

BIU-87細(xì)胞使用含10%胎牛血清(FBS)和100 U·ml-1青霉素、100 U·ml-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于含5%CO2的37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)。

1.2.2藥物配制

小白菊內(nèi)酯用二甲基亞砜(DMSO)溶液配制成濃度100 mmol·L-1的藥液， 4℃冰箱避光保存。

1.2.3MTT法檢測BIU-87細(xì)胞增殖活性

收集對數(shù)生長期BIU-87細(xì)胞，消化、計(jì)數(shù)并按5×103個(gè)·孔-1細(xì)胞接種于96孔板中，每孔加入100 μl細(xì)胞懸液，待細(xì)胞貼壁后，向?qū)嶒?yàn)組加入含不同濃度小白菊內(nèi)酯的RPMI-1640完全培養(yǎng)基100 μl，使得實(shí)驗(yàn)組小白菊內(nèi)酯的終濃度分別為15、30、60 μmol·L-1，另設(shè)對照組(加入同體積不含小白菊內(nèi)酯的完全培養(yǎng)基)，每組設(shè)5個(gè)副孔。分別使藥物孵育細(xì)胞24、48、72 h后棄上清，以MTT法測每組的吸光值(A490)，實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測BIU-87細(xì)胞凋亡率

對數(shù)生長期的BIU-87細(xì)胞經(jīng)消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度，按1×106個(gè)·孔-1細(xì)胞的密度接種于6孔板中。待細(xì)胞完全貼壁后，分別加入不同濃度藥液使得小白菊內(nèi)酯終濃度為15、30、60 μmol·L-1。另設(shè)對照組(加入等體積完全培養(yǎng)基)，每組設(shè)5個(gè)副孔。培養(yǎng)48 h后收集各組細(xì)胞，以4℃的PBS溶液洗滌3次后，用Annexin V-FITC及碘化丙啶(PI)(50 μg·ml-1)室溫避光染色15 min，用流式細(xì)胞儀檢測BIU-87細(xì)胞的凋亡情況。

1.2.5Real-time PCR檢測BIU-87細(xì)胞Bax、Bcl-2 mRNA表達(dá)

用15、30、60 μmol·L-1濃度的小白菊內(nèi)酯孵育BIU-87細(xì)胞48 h后，用Trizol法提取BIU-87細(xì)胞的總RNA，之后參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。再以cDNA為模板，采用Real-time PCR檢測bcl-2、bax mRNA的表達(dá)水平，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，bax/β-actin 、Bcl-2/β-actin密度比值顯示。PCR引物序列：β-actin(416 bp)上游引物：5′-GAGCTACGAGCTGCCTGACG-3′，下游引物：5′-CCTAGAAGCATTTGCGGTGG-3′；bcl-2(234 bp)上游引物：5′-GGATTGTGGCCTTCTTTGAG-3′，下游引物：5′-CCAAACTGAGCAGAGTCTTC-3′；bax(169 bp)上游引物：5′-TGCTTCAGGGTTTCATCCAG-3′，下游引物：5′-GGCGGCAATCATCCTCTG-3′。 反應(yīng)條件：50℃ 2 min，95℃ 10 min，95℃ 16 s，60℃ 55 s，共進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2結(jié)果

2.1小白菊內(nèi)酯抑制BIU-87細(xì)胞增殖活性

MTT實(shí)驗(yàn)顯示：與對照組比較，小白菊內(nèi)酯組BIU-87細(xì)胞增殖活性均受到明顯抑制，且抑制程度隨小白菊內(nèi)酯濃度增加和作用時(shí)間延長而增強(qiáng)，呈量效和時(shí)效關(guān)系，見圖1。

圖1　不同濃度小白菊內(nèi)酯孵育BIU-87細(xì)胞24、48、72 h后抑制增殖情況

2.2小白菊內(nèi)酯誘導(dǎo)BIU-87細(xì)胞凋亡

實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞經(jīng)不同濃度小白菊內(nèi)酯孵育48 h后，用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果顯示：小白菊內(nèi)酯組(15～60 μmol·L-1)BIU-87細(xì)胞發(fā)生不同程度的凋亡，與對照組細(xì)胞相比凋亡率均明顯升高，且隨藥物濃度的增加，凋亡率明顯遞增(P<0.05)，呈劑量依賴性凋亡，見圖2。

圖2　不同濃度小白菊內(nèi)酯孵育BIU-87細(xì)胞48 h后細(xì)胞凋亡情況注：與對照組比較，*P<0.05

2.3小白菊內(nèi)酯下調(diào)bcl-2 mRNA、上調(diào)bax mRNA表達(dá)

小白菊內(nèi)酯孵育BIU-87細(xì)胞48 h后采用Real-time PCR檢測顯示：與對照組相比，小白菊內(nèi)酯組(15～60 μmol·L-1)BIU-87細(xì)胞bcl-2 mRNA表達(dá)水平隨藥物濃度增加明顯降低(見圖3A)，bax mRNA表達(dá)水平隨藥物濃度增高明顯上升(見圖3B)，兩者都呈現(xiàn)劑量依賴性，各實(shí)驗(yàn)組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

(A)

(B)圖3　(A)不同濃度小白菊內(nèi)酯孵育BIU-87細(xì)胞48 h后bax/β-actin的比值;　(B)不同濃度小白菊內(nèi)酯孵育BIU-87細(xì)胞48 h后bcl-2/β-actin的比值注：與對照組比較，*P<0.05

3討論

現(xiàn)今膀胱癌的病因仍在研究中，生長因子、細(xì)胞因子以及激素等生物活性物質(zhì)參與了膀胱細(xì)胞癌變以及轉(zhuǎn)移的過程，這些活性物質(zhì)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)生異常，可引起某些基因的過度擴(kuò)增, 導(dǎo)致正常細(xì)胞接受了異常的增殖、分化和生長信號，最終促使細(xì)胞發(fā)生癌變[6,7]，因此，在細(xì)胞中存在多條與膀胱癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，如果能干擾其相關(guān)通路或可達(dá)到抑制腫瘤目的。植物來源的小白菊內(nèi)酯近年來被發(fā)現(xiàn)具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，在體外可抑制多種腫瘤細(xì)胞株的生長增殖，并誘導(dǎo)其凋亡，比如肝癌、膽管癌及多發(fā)性骨髓瘤等[8-10]，本實(shí)驗(yàn)以膀胱癌細(xì)胞BIU-87為模型，觀察小白菊內(nèi)酯對BIU-87的凋亡作用及初步探討其抗腫瘤機(jī)制。

MTT法是一種靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性好的細(xì)胞活性檢測方法。本實(shí)驗(yàn)用來檢測經(jīng)小白菊內(nèi)酯孵育后的BIU-87細(xì)胞增殖活性，發(fā)現(xiàn)隨著藥物作用濃度升高和時(shí)間增加，細(xì)胞增殖活性隨之明顯降低。同時(shí)流式細(xì)胞儀分析提示小白菊內(nèi)酯處理組BIU-87細(xì)胞發(fā)生了不同程度的凋亡現(xiàn)象，藥物濃度越高細(xì)胞凋亡率越高，呈劑量依賴性關(guān)系，這與MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，因此我們推測小白菊內(nèi)酯抑制細(xì)胞增殖活性與誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡相關(guān)。

細(xì)胞凋亡的調(diào)控失常是引發(fā)腫瘤發(fā)生的重要因素，現(xiàn)有研究表明線粒體通路是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要通路[11]，而bcl-2家族參與控制線粒體釋放凋亡因子[12]。Bc1-2和bax都屬于bc1-2家族[13]，BC1-2編碼蛋白抑制凋亡，BAX編碼蛋白促進(jìn)凋亡[14]。因此，下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)可使細(xì)胞易于凋亡，上調(diào)bax mRNA表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)中，Real-time PCR結(jié)果顯示隨著藥物濃度增加，BIU-87細(xì)胞bcl-2 mRNA的表達(dá)明顯下降，bax mRNA的表達(dá)明顯升高，表明小白菊內(nèi)酯是通過下調(diào)bcl-2 mRNA表達(dá)及上調(diào)bax mRNA表達(dá)誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞BIU-87的凋亡。

4結(jié)論

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們得出結(jié)論：小白菊內(nèi)酯對膀胱癌BIU-87細(xì)胞的增殖活性起明顯抑制作用，其機(jī)制可能與其誘導(dǎo)BIU-87細(xì)胞凋亡及下調(diào)bcl-2 mRNA和上調(diào)bax mRNA的表達(dá)相關(guān)，其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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Study on mechanism of parthenolide induced apoptosis in human bladder cancer cells BIU-87

Li Tao

(Department of Oncology, The First People Hospital of Qujing, Yunnan Qujing 655000)

AbstractObjective：To investigate the effects and the possible mechanism of parthenolide on the proliferation and apoptosis of BIU-87 cells. Methods: Human bladder cancer cells BIU-87 were treated by parthenolide in different concentrations (0, 10, 20 and 40 μmol·L-1). MTT assay was applied to determine the effect of parthenolide on proliferation of BIU-87 cells, while apoptosis was analyzed by flow cytometry. Next, the mRNA levels of bcl-2 and bax in BIU-87 cells were analyzed by RT-PCR. Results: After parthenolide treatment, parthenolide could inhibit the growth and proliferation of BIU-87 cells, with increased apoptotic rates by flow cytometry(P<0.05). The results from RT-PCR suggested that parthenolide treatment contributed to the reduced bcl-2 mRNA level and the elevated bax mRNA expression in BIU-87 cells(P<0.05). Conclusions: Parthenolide could significantly inhibit the proliferation of human bladder cancer cells BIU-87 by induction of apoptosis, which may be associated with inhibiting bcl-2 mRNA expression and activating bax mRNA expression.

Key Words:Parthenolide; BIU-87; Apoptosis; Bcl-2 mRNA; Bax mRNA

(收稿日期：2015-12-8)

作者簡介：李濤，男，主治醫(yī)師，主要從事腫瘤藥理研究，Email：yndq120@163.com。