徐佑?xùn)|　張艷　孟憲麗　曾勇　王平

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都　611137)

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論著

基于反向?qū)臃ǖ拇簏S酸抗炎作用的分子機(jī)制研究*

徐佑?xùn)|張艷孟憲麗曾勇王平△

(成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川 成都611137)

摘要目的：利用反向?qū)蛹夹g(shù)以大黃酸為研究對(duì)象篩選出大黃酸的炎癥靶標(biāo)蛋白。方法：獲取Toll樣受體/核因子(4TLR4/NF-κB)、p38促分裂原活化蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38 MAKP)和Janus激酶-信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子(Janus kinase 2/ signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)3條炎癥通路上的30個(gè)蛋白的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)以及大黃酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)；利用AutoDockTools對(duì)所有晶體學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理；通過AutoGrid對(duì)靶標(biāo)蛋白的活性位點(diǎn)進(jìn)行計(jì)算；利用AutoDock對(duì)大黃酸進(jìn)行反向?qū)幽M實(shí)驗(yàn)；對(duì)得到的對(duì)接結(jié)果進(jìn)行篩選，根據(jù)對(duì)接自由能的高低，篩選出親和力高的靶蛋白；對(duì)篩選得到的靶蛋白進(jìn)行作用力分析并作圖。結(jié)果：反向篩選得到3個(gè)與大黃酸具有高親和性的靶蛋白，分別為P38、PI3Kγ、JAK2。結(jié)論：大黃酸是通過抑制P38、PI3Kγ、JAK2靶蛋白，進(jìn)而阻礙炎癥信號(hào)傳遞，影響下游蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗炎作用。

關(guān)鍵詞：大黃酸；分子對(duì)接；JAK2/STAT3通路；NF-κB通路；炎癥；AutoDock

大黃酸為中藥大黃Rheum palmatum L.蒽醌衍生物中的活性成分，具有顯著抗炎作用[1]。大量研究顯示大黃酸能通過TLR4/NF-κB信號(hào)通路抑制NF-κB轉(zhuǎn)錄[2]，并且其還可以顯著下調(diào)LPS誘導(dǎo)的iNOS mRNA的表達(dá)水平，降低LPS所誘導(dǎo)的IL-1β、IL-6、IL-8表達(dá)量升高[3-5]。雖然大黃酸抗炎機(jī)制得到一定進(jìn)展，但是大多數(shù)研究還停留在動(dòng)物以及細(xì)胞階段，僅通過蛋白表達(dá)量以及抑制率的高低來評(píng)價(jià)大黃酸的抗炎效果。而大黃酸是競(jìng)爭(zhēng)性抑制了上述蛋白發(fā)揮了抗炎作用，還是與細(xì)胞膜表面受體(TLR4、TNFR)或細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)蛋白(NF-κB、TAK1、MyD88、IKKγ等)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合，從而阻斷信號(hào)通路，抑制下游炎癥細(xì)胞因子表達(dá)卻知之甚少。因此，有必要在分子水平上對(duì)大黃酸進(jìn)行深入的探究。

在炎癥應(yīng)答過程，TLR4/NF-κB信號(hào)通路涉及到多條信號(hào)通路的共同參與完成，并且信號(hào)通路間相互協(xié)同作用，增強(qiáng)炎癥的表達(dá)。其中，TLR4/NF-κB信號(hào)通路、JAK激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Janus kinase 2/ signal transducer and activator of transcription 3，JAK2/STAT3)以及P38絲裂原激活蛋白激酶(P38 mitogen-activated protein kinases，P38 MAKP)在炎癥應(yīng)答過程中不但起著重要作用而且彼此間聯(lián)系緊密。實(shí)驗(yàn)顯示，NF-κB的活化將誘導(dǎo)一氧化氮合成酶(Inducible nitric oxide synthase，iNOS)、環(huán)氧酶2(Cyclooxygenase-2，COX-2)、金屬基質(zhì)螯合蛋白酶(Matrix metallopeptidase 9，MMP-9)的表達(dá)[6-9]。在LPS刺激下，P38蛋白被激活將遷移進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控NF-κB的表達(dá)，使NF-κB介導(dǎo)的下游蛋白表達(dá)增加[10]。另外，JAK2/STAT3信號(hào)通路也能通過PI3K/PDK1/Akt 通路來調(diào)控NF-κB的表達(dá)，同樣TLR4/NF-κB信號(hào)通路也可以利用PI3K/Akt/mTOR通路與STAT3協(xié)同作用，促進(jìn)IL-6、IL-10、IL-11、IL-18、IL-21、IL-23、IL-27等炎癥因子活化[11,12]。因此，完整的大黃酸的抗炎實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行多個(gè)蛋白的活性抑制實(shí)驗(yàn)，從而獲得詳盡蛋白活性抑制信息。

目前，證明配體與靶蛋白相互作用的最直接的手段主要包括：蛋白晶體學(xué)解析、蛋白熒光猝滅以及分子反向?qū)蛹夹g(shù)[13-15]。蛋白晶體學(xué)解析對(duì)蛋白純化要求極高而且成本昂貴，因此只能對(duì)單個(gè)明確的靶蛋白展開研究。熒光淬滅實(shí)驗(yàn)，雖然對(duì)蛋白要求較低，但是若進(jìn)行多靶標(biāo)蛋白的驗(yàn)證，將會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)周期過長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)量增大，從而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)成本過于高昂。

反向?qū)蛹夹g(shù)是目前較為準(zhǔn)確的靶蛋白篩選手段，該技術(shù)以分子對(duì)接技術(shù)作為基礎(chǔ)，以單一或者多個(gè)配體作為研究對(duì)象，對(duì)大批量的蛋白進(jìn)行對(duì)接篩選，再根據(jù)對(duì)接能量高低排序并分析，找出潛在的靶標(biāo)蛋白。該技術(shù)手段已經(jīng)得到廣泛運(yùn)用[16]，為藥物的重新定義以及藥物設(shè)計(jì)做出了巨大貢獻(xiàn)。因此在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前，首先運(yùn)用分子反向?qū)蛹夹g(shù)篩選出潛在的靶標(biāo)蛋白(反向?qū)蛹夹g(shù)[17,18])，選取具有較高親和力的靶標(biāo)蛋白，再對(duì)這些蛋白進(jìn)行蛋白水平實(shí)驗(yàn)，這樣可以減少實(shí)驗(yàn)所需靶標(biāo)蛋白數(shù)量提高實(shí)驗(yàn)效率，同時(shí)也能在保證可信度的基礎(chǔ)上降低實(shí)驗(yàn)成本。

基于此思路及結(jié)合大黃酸抗炎機(jī)理的研究現(xiàn)狀，本文利用反向?qū)蛹夹g(shù)，對(duì)炎癥通路相關(guān)的30蛋白進(jìn)行反向?qū)?，以篩選出大黃酸抗炎作用的直接作用靶蛋白，并對(duì)大黃酸與靶標(biāo)蛋白間相互作用進(jìn)行分析，以期探究大黃酸抗炎作用的分子機(jī)制，并為以大黃酸為母核的新型抗炎先導(dǎo)化合物的結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)提供相關(guān)方向。

1材料與方法

本實(shí)驗(yàn)以TLR4/NF-κB、P38、JAK2/STAT3炎癥通路上30個(gè)蛋白為研究對(duì)象(相關(guān)蛋白詳見表1)，所有蛋白的晶體結(jié)構(gòu)均從RCSB Protein Data Bank(PDB)上下載并保存為PDB格式。晶體結(jié)構(gòu)中的所有雜原子、結(jié)晶水以及本身結(jié)構(gòu)解析時(shí)所攜帶的配體全部去除，并添加極性氫，計(jì)算高斯電荷。以上所有優(yōu)化過程均在AutoDock Tools-1.5.6rc3軟件上完成。

大黃酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)從PubChem上獲取，文件保存為3D SDF格式。配體結(jié)構(gòu)通過Swiss-PDB Viewer V.4.02中的GRO-MOS96模塊進(jìn)行MM-2能量?jī)?yōu)化。

將上述處理的蛋白受體作為大黃酸(配體)反向?qū)优c虛擬篩選的酶靶。在模擬過程中，配體允許自由旋轉(zhuǎn)。AutoGrid模塊利用對(duì)應(yīng)配體原子(C，N和O)的探針原子在靶點(diǎn)蛋白的活性區(qū)域進(jìn)行探測(cè)并生成勢(shì)能圖。AutoDock選擇拉馬克遺傳算法(Lamarckian genetic-algorithm，GA)來模擬計(jì)算配體與靶點(diǎn)蛋白活性位點(diǎn)間的親和力。對(duì)接過程選用半柔性對(duì)接，運(yùn)行次數(shù)為100次，最大能量評(píng)價(jià)為5000000，種群數(shù)量為150，其余參數(shù)采用默認(rèn)值。

最后，選用PyMOL1.5.0.4(Python molecule，PyMOL)與LigPlot+進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

2結(jié)果

2.1對(duì)接方法的檢驗(yàn)

為了檢驗(yàn)對(duì)接方法的可靠性，選取4個(gè)晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID:2B7A,3HR4，3UVQ，4EZJ)進(jìn)行重復(fù)對(duì)接實(shí)驗(yàn)。對(duì)接結(jié)果顯示，配體對(duì)接的構(gòu)象與原晶體結(jié)構(gòu)上配體構(gòu)象相似，并且根據(jù)檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，重復(fù)對(duì)接實(shí)驗(yàn)的RMSD值均小于2.0?，說明重復(fù)對(duì)接實(shí)驗(yàn)是成功的，對(duì)接方案是可信的。

(A)2B7A

(B)3HR4

(C)3UVQ

(D)4EZJ圖1　重復(fù)對(duì)接結(jié)果注：藍(lán)色的配體為晶體結(jié)構(gòu)上的原配體，黃色配體為重復(fù)對(duì)接構(gòu)象，兩個(gè)構(gòu)象疊合對(duì)比顯示。

2.2大黃酸反向?qū)咏Y(jié)果

大黃酸與3條炎癥通路靶標(biāo)蛋白的對(duì)接結(jié)果顯示，大黃酸對(duì)蛋白激酶具有更高的親和力，尤其是對(duì)P38、PI3Kγ(PDB ID：3UVQ、4EZJ)的ATP催化位點(diǎn)的結(jié)合能力最強(qiáng)，對(duì)接自由能分別為：-9.05、-9.01 kcal·mol-1，抑制常數(shù)分別為250.48、230.75 nM·L-1。另外，大黃酸與JAK2(PDB ID：2B7A)靶點(diǎn)蛋白的結(jié)合能力稍弱，自由結(jié)合能為：-8.08 kcal·mol-1,抑制常數(shù)為1.19 μM·L-1。

表1　大黃酸與炎癥靶標(biāo)蛋白對(duì)接數(shù)據(jù)

注：*：I類構(gòu)象為最優(yōu)構(gòu)象相似的對(duì)接結(jié)果，相似構(gòu)象間的能量差異不大于-1 kcal·mol-1；△：對(duì)接自由能反應(yīng)了配體與蛋白之間的親和力，對(duì)接自由能越低，親和力越高。

此外，大黃酸對(duì)TAK1(PDB ID：2EVA)、IA型PI3K蛋白激酶家族(PI3Kα：4JPS，PI3Kβ：4BFR， PI3Kδ：4EZJ)、Akt1、Akt2、IKKβ(PDB ID：3MVH、2JDR、4KIK)也有較高的親和性。另外，大黃酸與COX-2、iNOS(PDB ID：3NT1、3HR4)也具有較高親和力。

2.3大黃酸與關(guān)鍵靶標(biāo)蛋白作用模式

如圖2所示，大黃酸的羥基、羰基以及羧基是形成氫鍵作用的位點(diǎn)，這些氫鍵是穩(wěn)定大黃酸與ATP位點(diǎn)相互作用的關(guān)鍵因素。由于大黃酸共軛結(jié)構(gòu)，其與JAK2的Tyr931之間還產(chǎn)生π間還堆積效應(yīng)(如圖C2所示)。大黃酸與P38、PI3Kγ、JAK2 ATP位點(diǎn)的穩(wěn)定結(jié)合的另一個(gè)作用力——疏水作用，為大黃酸的蛋白親和做出了較大貢獻(xiàn)。如圖所示，大黃酸與3個(gè)蛋白上的構(gòu)成ATP位點(diǎn)的殘基形成疏水作用，并且與活性區(qū)域形成構(gòu)型互補(bǔ)，從而牢牢的結(jié)合在活性位點(diǎn)上。

圖2　大黃酸與P38、PI3Kγ、JAK2的對(duì)接模式圖A1、A2為大黃酸與P38 ATP位點(diǎn)的作用模式；B1、B2為大黃酸與PI3Kγ ATP位點(diǎn)的作用模式；C1、C2為大黃酸與JAK2 ATP位點(diǎn)作用模式。在3D示意圖中，靶蛋白以二級(jí)結(jié)構(gòu)顯示，大黃酸以球棍模型顯示，殘基以棍棒模型顯示。在平面示意圖中，輻射狀弧形代表疏水作用的殘基，虛線代表氫鍵，球棍模型為大黃酸。

3討論

分子反向?qū)蛹夹g(shù)是基于分子對(duì)接的逆運(yùn)用，其以配體作為研究對(duì)象，蛋白作為靶標(biāo)進(jìn)行靶蛋白的篩選。本實(shí)驗(yàn)選擇NF-κB、P38、JAK2/STAT3 3條通路上的30個(gè)蛋白進(jìn)行反向?qū)印＝Y(jié)果顯示，大黃酸與P38、PI3Kγ、JAK2靶蛋白具有較高親和力。

P38是炎癥信號(hào)通路上的關(guān)鍵靶蛋白，其能夠進(jìn)入細(xì)胞核調(diào)控多種核轉(zhuǎn)錄因子，如環(huán)磷腺苷反應(yīng)元件鏈接蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、轉(zhuǎn)錄活化因子-2(Activated transfer factor 2，ATF-2)、NF-κB等轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)，還能影響炎性細(xì)胞因子，如TGF-β1、TNF-α、IL的合成，并且參與炎癥細(xì)胞的活化[19]。 Huang J、Alam JJ、Studer RK等研究證實(shí)P38激酶的抑制制影響NF-κB的轉(zhuǎn)錄，降低iNOS、COX-2、IL的表達(dá)[20,21]。 PI3K激酶是NF-κB通路與JAK2/STAT3通路的“交匯”，磷酸化的PI3K可以通過PDK1/Akt通路激活NF-κB并促進(jìn)iNOS的表達(dá)。研究顯示[22,23]，PI3Kγ在免疫細(xì)胞內(nèi)高度表達(dá)并且在炎癥應(yīng)答過程中起著重要的介導(dǎo)作用。Hee Jung Kim和Randall S. Frey的研究發(fā)現(xiàn)[24,25]，PI3Kγ的抑制能夠顯著減少LPS所引起的氧化自由基的產(chǎn)生，并且極大程度上抑制的NF-κB的活化，減少下游炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，從而緩解炎癥。JAK2/STAT3通路可介導(dǎo)多種細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)導(dǎo)，JAK2的磷酸化可激活STAT3進(jìn)入細(xì)胞核并介導(dǎo)多種炎癥因子生成，如iNOS、MMP-9、COX-2、IL-6、IL-1β、PG。

對(duì)接結(jié)果表明P38、PI3Kγ、JAK2的ATP位點(diǎn)極有可能為大黃酸的直接作用靶位，這一直接作用的繼發(fā)效果表現(xiàn)出阻礙TLR4/NF-κB信號(hào)通路，降低NF-κB的活化等作用。而大黃酸對(duì)相關(guān)下游蛋白及核轉(zhuǎn)錄的影響已有大量文獻(xiàn)報(bào)道[26,27]。

能量分析表明，大黃酸與相關(guān)蛋白激酶結(jié)合能力均較強(qiáng)，如P38、PI3Kγ、JAK2、IA型PI3Ks、Akt1、Akt2、TAK1、IKKβ等。這可能與人類激酶的ATP區(qū)域(激酶區(qū)域)都有著序列和結(jié)構(gòu)的高度保守性有關(guān)[28]。在ATP與激酶的結(jié)合過程中，高度共軛腺嘌呤負(fù)責(zé)與激酶區(qū)域牢固地結(jié)合，而大黃酸蒽醌母核的高度共軛的特性與腺嘌呤相似，所以大黃酸可以像ATP的腺嘌呤環(huán)一樣的結(jié)合到激酶區(qū)域，并且ATP區(qū)域狹窄的構(gòu)象特點(diǎn)也使得大黃酸可以有效地形成構(gòu)型互補(bǔ)，從而與蛋白激酶結(jié)合阻礙炎癥應(yīng)答，發(fā)揮抗炎作用。

從對(duì)接受力分析，大黃酸的共軛結(jié)構(gòu)可與殘基之間形成π-π堆積以及cation-a相互作用，并且大黃酸的多羥基、羰基結(jié)構(gòu)負(fù)責(zé)與殘基形成重要的氫鍵作用，這些特征性結(jié)構(gòu)在大黃酸的穩(wěn)定結(jié)合過程中發(fā)揮著重要作用。這些結(jié)構(gòu)特征提示在設(shè)計(jì)P38、PI3Ks、JAK2等激酶的抑制劑時(shí)，通過加入1、8位的羥基基團(tuán)，以及9、10的羰基基團(tuán)可以提高配體的親和力，并且降低配體的旋轉(zhuǎn)勢(shì)能增加共軛度，將有利于配體與蛋白激酶ATP位點(diǎn)的結(jié)合。

綜上所述，炎癥通路靶位反向?qū)訉?shí)驗(yàn)表明大黃酸抗炎作用的直接靶蛋白可能為胞內(nèi)P38、PI3Kγ和JAK2的高度保守ATP位點(diǎn)。這一結(jié)果為進(jìn)一步明確蒽環(huán)類物質(zhì)的抗炎機(jī)制提供了新的研究側(cè)重點(diǎn)，也為相應(yīng)新型先導(dǎo)化合物合成提供了初步的構(gòu)效關(guān)系指征。

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Study on anti-inflammatory mechanism of rhein based on reverse docking method*

Xu You-dong, Zhang Yan, Meng Xian-li, Zeng Yong, Wang Ping△

(Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137)

AbstractObjective：To investigate the mechanism of anti-inflammation of rhein through the approach of reverse docking, which was utilized to dock rhein with proteins in the signal pathways of NF-κB、P38 and JAK2/STAT3. Methods: Thirty proteins of NF-κB、P38 and JAK2/STAT3 pathway were obtained from PDB website, the structure of rhein was obtained from PubChem website. All the proteins were processed with standardization disposal of AutoDockTools. Then AutoGrid was utilized to calculate the grids of active sites. The docking result has been ranked according to docking energy, for the purpose of selecting out the proteins with high affinity for rhein. Results: Three target proteins including P38, PI3Kγ and JAK2 were found to interact with rhein with high affinity. Conclusion: Anti-inflammation of rhein relates to its function of competitive inhibition for the 3 target proteins, and the behavior of rhein results in the obstruction to signal pathways. Finally the purpose of treatment for inflammation has been achieved by this method.

Key Words:Rhein; Molecular docking; Pathway of JAK2/STAT3; Pathway of NF-κB; Inflammation; AutoDock

(收稿日期：2016-1-20)

作者簡(jiǎn)介：徐佑?xùn)|，男，在讀研究生，主要從事藥理學(xué)研究，E-mail：xydarticle@hotmail.com?！魍ㄓ嵶髡撸和跗?，男，副教授，主要從事中藥藥代動(dòng)力學(xué)研究，Email：viviansector@aliyun.com。

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(編號(hào)：81274111)