馮忠軍，馮彥蕊，聞海豐，孫　寅(.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 05005；.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧 709)

?

·論著·

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中miR-16的表達(dá)

馮忠軍1，馮彥蕊1，聞海豐1，孫寅2(1.河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院檢驗(yàn)科，河北 石家莊 050051；2.濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 濟(jì)寧 272029)

[摘要]目的通過檢測(cè)miR-16在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)患者血漿和關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)，探討其在RA鑒別診斷以及病情評(píng)估中的應(yīng)用價(jià)值。方法應(yīng)用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)RA患者血漿、關(guān)節(jié)滑液以及單核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中miR-16的表達(dá)水平，以U6snRNA為內(nèi)參，另有10例骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)作病例對(duì)照。結(jié)果目的基因miR-16和內(nèi)參U6snRNA的擴(kuò)增曲線及熔解曲線均良好，未出現(xiàn)非特異性產(chǎn)物及引物二聚體現(xiàn)象。miR-16在血漿中表達(dá)水平顯著高于關(guān)節(jié)滑液和外周血PBMC(P<0.01)；miR-16在RA患者PBMC中的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。與OA患者相比，miR-16在RA患者關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。血漿中miR-16表達(dá)與疾病活動(dòng)度量表(Disease Activity Score,DAS28)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與紅細(xì)胞沉降率( erythrocyte sedimentation rate，ESR)及C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)均無相關(guān)性(P>0.05)；PBMC中miR-16表達(dá)與DAS28評(píng)分、ESR及CRP均呈正相關(guān)(P<0.05)；關(guān)節(jié)滑液中miR-16表達(dá)與DAS28評(píng)分、ESR及CRP均無相關(guān)性(P>0.05)。結(jié)論莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量PCR法是靈敏而且特異的miRNA檢測(cè)方法。血漿和關(guān)節(jié)滑液miR-16的來源并不相同，在血漿和關(guān)節(jié)滑液中可能存在不同的miRNA表達(dá)譜。miR-16的表達(dá)水平可望用于RA與OA的鑒別診斷以及作為RA病情活動(dòng)度的有效評(píng)價(jià)指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞]關(guān)節(jié)炎，類風(fēng)濕；滑液；微RNAs

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.013

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種以慢性多滑膜關(guān)節(jié)炎和關(guān)節(jié)外病變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)的自身免疫病，致殘率較高，而臨床常用的影像學(xué)、組織學(xué)、血清學(xué)等診斷方法存在很大的缺陷。微小RNA(microRNA,miRNA)作為重要的免疫調(diào)控分子，通過調(diào)控mRNA的翻譯，引起蛋白質(zhì)的表達(dá)改變，從而影響生物效應(yīng)。盡管其功能尚未完全闡明，但研究發(fā)現(xiàn)，miRNA具有很強(qiáng)的細(xì)胞、組織或疾病特異性，顯示了其作為疾病診斷標(biāo)志物的某些特征[1-3]。本研究采用莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物的SYBR Green Ⅰ實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(stem-loop real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，stem-loop FQ-PCR)法檢測(cè)RA患者血漿及關(guān)節(jié)滑液中miR-16的表達(dá)水平，并結(jié)合疾病活動(dòng)度量表(Disease Activity Score，DAS28)評(píng)分及某些實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)進(jìn)行分析,旨在探討其在RA早期篩選、鑒別診斷以及病情評(píng)估中的作用。

1資料與方法

1.1一般資料選擇2012年4月—2013年1月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院免疫風(fēng)濕科確診的RA患者30例,均符合美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年修訂的RA分類標(biāo)準(zhǔn)。男性8例，女性22例，年齡38～69歲，平均(50.28±7.09)歲，其中16例留取關(guān)節(jié)滑液,同時(shí)記錄DAS28評(píng)分、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)及C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)等臨床相關(guān)資料。骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis，OA)患者10例，來自同期關(guān)節(jié)骨科門診并排除其他自身免疫性疾病，男性3例，女性7例，年齡35～67歲，平均(50.90±6.17)歲。正常對(duì)照組20例，均排除自身免疫、肝臟、心腦血管疾病,男5例，女15例，年齡32～60歲，平均(48.01±4.11)歲。3組受試者性別和年齡差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，具有可比性。

所有研究對(duì)象均對(duì)相關(guān)研究知情同意。

1.2方法

1.2.1儀器與試劑ND-2000型超微量核酸蛋白測(cè)定儀(美國Nanodrop公司)，ABI7300型實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國Applied Biosystems公司)，miRNA快速提取試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)，Hsa-mir-16熒光定量PCR引物試劑盒及EzOmics實(shí)時(shí)定量PCR試劑盒(南通百奧邁科生物技術(shù)有限公司)。

1.2.2標(biāo)本采集與總RNA提取采集受試者乙二胺四乙酸二鉀(ethylene diamine tetraacetic acid-K2,EDTA-K2)抗凝靜脈血3 mL，分別提取血漿和外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)中總RNA。無菌抽取的關(guān)節(jié)滑液經(jīng)離心后取上清液于12 h內(nèi)提取總RNA。提取方法按照操作說明書進(jìn)行。純化的總RNA經(jīng)純度和濃度檢測(cè)(OD260/OD280在1.6～2.0范圍)及完整性鑒定(1.2%瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)28 s、18 s和5 s等3條帶，并且28 s條帶亮度約是18 s條帶的1.5～2.0倍)后用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)。所有樣本均于-70 ℃保存待用。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)miR-16用RNase free水調(diào)整上述RNA樣本濃度后，根據(jù)標(biāo)本數(shù)量，分別為目的基因miR-16和內(nèi)參基因U6snRNA配制反應(yīng)液并分裝(每個(gè)樣本反應(yīng)體積均為20 μL)，全程冰上操作。①miR-16反應(yīng)體系如下：2×Master Mix 12.5 μL；50×SYBR Green Ⅰ 0.5 μL；RT primer 0.5 μL；Forward Primer(5μmol) 0.5 μL；Reverse Primer(5 μmol)0.5 μL；DEPC-H2O 5.5 μL。②U6snRNA反應(yīng)體系如下：2×Master Mix 12.5 μL；50×SYBR Green Ⅰ 0.5 μL；U6snRNA Forward Primer(5μmol)0.5 μL；U6snRNA Reverse Primer(5μmol)0.5 μL；DEPC-H2O 6 μL。向每個(gè)反應(yīng)管中分別加入RNA模板5 μL，樣本最終反應(yīng)體系為25 μL。同時(shí)，使用不含模板的陰性對(duì)照(no template control,NTC)來判斷反應(yīng)過程中是否出現(xiàn)引物二聚體污染。按照以下反應(yīng)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反轉(zhuǎn)錄：42 ℃ 60 min，1個(gè)循環(huán)；預(yù)變性：95 ℃熱啟動(dòng)10 min，1個(gè)循環(huán)；擴(kuò)增：95 ℃變性20 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，于72 ℃處收集熒光，共40個(gè)循環(huán)；55～95 ℃每上升1 ℃收集1次熒光。創(chuàng)建熔解曲線，反應(yīng)參數(shù)為：95 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，55～95 ℃，以0.1 ℃/s的速率升溫，整個(gè)過程連續(xù)采集熒光。

1.3數(shù)據(jù)處理PCR的結(jié)果以Ct值表示,數(shù)據(jù)處理采用比較Ct值法，△Ct目的基因=每個(gè)標(biāo)本的目的基因Ct值-內(nèi)參基因Ct值，△△Ct目的基因=處理組△Ct目的基因值-對(duì)照組△Ct目的基因值，miR-16與U6相對(duì)表達(dá)量用2-△△Ct方法計(jì)算，2-△△Ct值表示病例組miRNA的表達(dá)水平相對(duì)于對(duì)照組的差異倍數(shù)，變化倍數(shù)大于>2為高表達(dá)，變化倍數(shù)<0.5為低表達(dá)。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。由于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并不滿足正態(tài)分布和方差齊性條件，故數(shù)據(jù)以中位數(shù)(25%～75%)[M(Q1，Q3)]表示，采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定經(jīng)電泳檢測(cè)，miR-16和U6與預(yù)期片段大小(分別為75 bp和100 bp)相符，條帶清晰，無拖尾現(xiàn)象。

2.2擴(kuò)增曲線及熔解曲線分析所有樣本擴(kuò)增曲線呈典型S型，平臺(tái)期大致平行，提示各孔反應(yīng)運(yùn)行良好，且擴(kuò)增效率基本一致；Ct值在18～35之間，說明本次實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)有效，可以用來進(jìn)行基因表達(dá)量的對(duì)比分析。所有樣本解鏈曲線均為單一峰值，而且峰線窄而尖，Tm值約為78 ℃左右，未出現(xiàn)雜峰，表明PCR產(chǎn)物單一，無非特異性擴(kuò)增；NTC解鏈曲線無特異性主峰出現(xiàn)，說明并不存在引物二聚體污染。

2.3miR-16表達(dá)水平比較及其與臨床指標(biāo)的關(guān)系

2.3.1miR-16在RA血漿中的表達(dá)miR-16在血漿中的水平顯著高于關(guān)節(jié)滑液和PBMCs(P<0.01)。關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)水平高于PBMCs，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。miR-16在RA組血漿中的表達(dá)水平低于正常對(duì)照組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；在PBMCs中的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照組(P<0.01)。與OA患者相比，miR-16在RA患者關(guān)節(jié)滑液中的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)。見表1～3。

2.3.2相關(guān)性分析血漿中miR-16表達(dá)與DAS28評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，與ESR和CRP均無相關(guān)性(P>0.05)；PBMC中miR-16表達(dá)與DAS28評(píng)分、ESR及CRP均呈正相關(guān)(P<0.05)；關(guān)節(jié)滑液中miR-16表達(dá)與DAS28評(píng)分、ESR及CRP均無相關(guān)性(P>0.05)。見表4。

表1　RA患者不同標(biāo)本中miR-16表達(dá)比較

*P<0.05與關(guān)節(jié)滑液比較#P<0.05與PBMC比較(秩和檢驗(yàn))

表2　RA組和正常對(duì)照組血漿和PBMC中

表3　RA組與OA組關(guān)節(jié)滑液中miR-16表達(dá)比較

表4　RA患者不同組織miR-16表達(dá)水平與DAS28評(píng)分、ESR及CRP的相關(guān)性

3討論

RA是一種嚴(yán)重危害人類健康的、以滑膜組織慢性炎癥病變?yōu)轱@著特征的疾病，但早期癥狀并不典型，確診時(shí)已出現(xiàn)關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞而錯(cuò)失最佳治療時(shí)機(jī)。人們?nèi)栽诓粩鄬ふ夷軌蛴糜赗A早期篩選的新一代診斷指標(biāo)。miRNA是一類大小19～23個(gè)堿基的內(nèi)源性非編碼單鏈相對(duì)小分子質(zhì)量RNA，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)超過700種，其在血清/血漿中的含量十分穩(wěn)定，可抵抗RNA酶降解，也可耐受強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、煮沸及反復(fù)凍融等各種極端條件[1]。近年來在血清/血漿、尿液、唾液及陰道分泌物等體液中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了miRNA分子的存在[4-6]。體液miRNA與組織/細(xì)胞miRNA一樣，在不同病理狀態(tài)下呈現(xiàn)特異性改變，在正常和病理組織中，miRNA表達(dá)水平存在差異，即使在不同分化時(shí)期的同一組織，其表達(dá)水平也不同。miRNA參與了T、B淋巴細(xì)胞分化和天然免疫反應(yīng)，并調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，在轉(zhuǎn)錄后水平通過表達(dá)量的上調(diào)或下調(diào)影響細(xì)胞的發(fā)育和疾病過程[1]，在炎性細(xì)胞的發(fā)育、炎性分子的表達(dá)等方面都有重要調(diào)節(jié)作用，最終影響炎性反應(yīng)的進(jìn)程和結(jié)果。目前至少發(fā)現(xiàn)10種miRNA在RA中異常表達(dá)(miRNA-16、miRNA-124a、miRNA-132、iRNA-146a、miRNA-155、miRNA-203、miRNA-223、miRNA-346、miRNA-363、miRNA-498)[7]。miRNA-124a和miRNA-363下調(diào)，7個(gè)上調(diào)，只有1個(gè)miRNA的研究結(jié)果是相互矛盾的，miRNA-132在分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞中高表達(dá)，但在血漿樣品中與對(duì)照組相比表達(dá)降低[3]。miR-16位于13號(hào)染色體長(zhǎng)臂1區(qū)4帶(13q14)，通過靶向作用bcl-2蛋白的表達(dá)而降低細(xì)胞的增殖和侵襲能力并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,miR-16極有可能影響炎性因子的表達(dá)從而參與炎癥的發(fā)病過程[2,8]。

Stem-loop RT-qPCR法使用5′端為特殊莖環(huán)結(jié)構(gòu)的逆轉(zhuǎn)錄引物，與miRNA結(jié)合時(shí)不與莖環(huán)序列嚴(yán)格配對(duì)的miRNA無法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,從而可實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)miRNA分子的特異性篩選，采用SYBR Green Ⅰ染料滲入法檢測(cè)信號(hào)靈敏度高,特異性好。miR-16和U6擴(kuò)增產(chǎn)物分別經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和全程熔解曲線分析，結(jié)果均表明未出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增和引物二聚體現(xiàn)象，提示熔解曲線分析可有效區(qū)分特異及非特異性PCR產(chǎn)物；此外，擴(kuò)增曲線呈典型S型，指數(shù)期明顯，平臺(tái)期一致,CT值基本在有效范圍內(nèi)，提示莖環(huán)逆轉(zhuǎn)錄引物特異性高，可將目的基因與miRNA前體、同一家族miRNA成員以及基因組DNA等區(qū)分開來。我們采用該法檢測(cè)RA患者血漿和關(guān)節(jié)滑液miR-16的表達(dá)水平，所需樣本量也很少，只需提供100 ng左右的總RNA即可檢測(cè)到miRNA的存在，是一種靈敏而且特異的miRNA定量檢測(cè)方法。

本研究結(jié)果顯示，在RA患者關(guān)節(jié)滑液與血漿中均可檢測(cè)到miR-16的表達(dá)，關(guān)節(jié)滑液和PBMC中miR-16的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是血漿組miR-16的表達(dá)水平卻顯著高于關(guān)節(jié)滑液。miR-16的表達(dá)量差異如此之大，提示血漿、關(guān)節(jié)滑液及PBMC中的來源并不相同，彼此之間沒有相關(guān)性，在血漿、關(guān)節(jié)滑液及PBMC中有可能存在不同的miRNA表達(dá)譜[9]。血漿miR-16的表達(dá)水平顯著高于關(guān)節(jié)滑液和PBMC，由此我們推測(cè)全身各組織分泌及細(xì)胞內(nèi)RNA的破碎釋放極有可能是血漿miR-16的主要來源。與OA患者相比，RA患者關(guān)節(jié)滑液miR-16的表達(dá)水平明顯升高，有望成為RA診斷及與OA鑒別診斷的新一代分子標(biāo)志物。

DAS28評(píng)分、ESR和CRP是反映疾病活動(dòng)度和炎癥程度的常用指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，miR-16在RA患者PBMC中的表達(dá)水平不僅顯著高于正常對(duì)照組，并且其表達(dá)量與DAS28評(píng)分、ESR及CRP均呈顯著正相關(guān)。與相關(guān)報(bào)道相同[2,10]。提示PBMC中miR-16的表達(dá)上調(diào)與RA病情活動(dòng)度和炎癥程度有密切關(guān)系，miR-16與RA成纖維細(xì)胞增殖及滑膜細(xì)胞炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[10-13]。另外，RA患者血漿miR-16的表達(dá)與DAS28評(píng)分呈顯著負(fù)相關(guān)，但樣本數(shù)量較少，需要加大樣本數(shù)量進(jìn)一步證實(shí)數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性及可重復(fù)性。

免疫細(xì)胞的參與在RA的發(fā)病過程中發(fā)揮了十分重要的作用。T細(xì)胞可通過細(xì)胞間相互作用誘導(dǎo)細(xì)胞因子及炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生,從而加重機(jī)體的炎癥反應(yīng)并最終導(dǎo)致關(guān)節(jié)組織的破壞。因而miR-16在PBMC(主要為淋巴細(xì)胞)的表達(dá)水平與血漿、關(guān)節(jié)滑液相比更能反映患者機(jī)體的炎癥程度和病情的活動(dòng)度?；簃iR-16則有可能直接來源于病變滑膜組織以及浸潤細(xì)胞的分泌，其過度表達(dá)與滑膜局部炎癥刺激有很大的關(guān)系，更能反映關(guān)節(jié)滑膜的病變程度。miR-16所引起的炎癥反應(yīng)很可能是眾多靶基因共同作用并且相互影響的結(jié)果，其與DAS28評(píng)分的顯著相關(guān)性也強(qiáng)烈提示在RA錯(cuò)綜復(fù)雜的病因?qū)W網(wǎng)絡(luò)中，miR-16及其靶基因是非常重要的組成部分。但是目前與RA病程相關(guān)的miR-16的靶基因并未明了，miR-16如何參與RA的發(fā)病機(jī)制，需要進(jìn)一步研究。

綜上所述，關(guān)節(jié)滑液miR-16可望用于RA與OA的鑒別診斷，血漿miR-16可望用作評(píng)估RA病情的有效指標(biāo)。盡管其詳細(xì)的作用機(jī)制尚不清楚，但不能否定其潛在的診斷價(jià)值。而進(jìn)一步深入研究miR-16及其靶基因的表達(dá)及其對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制，可能為及時(shí)阻止RA患者病情發(fā)展、降低致殘率及提高生活質(zhì)量帶來新的希望。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Bartel DP. microRNAs:genomics,biogenesis,mechanism,and function[J]. Cell,2004,116(2):281-297.

[2]Pauley KM,Satoh M,Chan AL,et al. Upregulated miR-146a expression in peripheral blood mononuclear cells from rheumatoid arthritis patients[J]. Arthritis Res Ther,2008,10(4):R101.

[3]Duroux-Richard I,Jorgensen C,Apparailly F. miRNAs and rheumatoid arthritis-promising novel biomarkers[J]. Swiss Med Wkly，2011，141(3):w13175.

[4]Ceribelli A,Nahid MA,Satoh M,et al. MicroRNAs in rheumatoid arthritis[J]. FEBS Lett，2011,585(23):3667-3674.

[5]Hanke M,Hoefig K,Merz H,et al. A robust methodology to study urine microRNA as tumor marker:microRNA-126 and microRNA-182 are related to urinary bladder cancer[J]. Urol Oncol,2010,28(6):655-661.

[6]Zubakov D,Boersma AW,Choi Y,et al. microRNA markers for forensic body fluid identification obtained from microarray screening and quantitative RT-PCR confirmation[J]. Int J Legal Med,2010,124(3):217-226.

[7]Duroux-Richard I,Presumey J,Courties G,et al. microRNAs as new player in rheumatoid arthritis[J]. Join Bone Spine，2011，78(1):17-22.

[9]Mookherjee N,El-Gabalawy HS. High degree of correlation between whole blood and PBMC expression levels of miR-155 and miR-146a in healthy controls and rheumatoid arthritis patients[J]. J Immunol Methods，2013，400/401(12)：106-110.

[10]馮知濤，李娟，任潔，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血miR-146a及miR-16的表達(dá)及與病情活動(dòng)的相關(guān)性研究[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2011,31(2):320-324.

[11]呂廣衛(wèi)，董士民.微小RNA與心肌肥大[J].臨床薈萃，2013，28(6):716-718.

[12]Okuhara A， Nakasa T， Shibuya H，et al. Changes in microRNA expression in peripheral mononuclear cells according to the progression of osteoarthritis[J]. Mod Rheumatol,2012,22(3):446-457.

[13]Murata K,Yoshitomi H,Tanida S,et al. Plasma and synovial fluid microRNAs as potential biomarkers of rheumatoid arthritis and osteoarthritis[J]. Arthritis Res Ther,2010,12(3):R86.

(本文編輯：劉斯靜)

Expression of miR-16 in plasma and synovial fluid of patients with rheumatoid arthritis

FENG Zhong-jun1, FENG Yan-rui1, WEN Hai-feng1, SUN Yin2

(1.Department of Laboratory Medicine， the Third Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050051， China；2.Department of Laboratory Medicine， the Affiliated Hospital of Jining Medical College， Jining 272029， China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the expression levels of miR-16 in plasma and synovial fluid from patients with rheumatoid arthritis(RA),and to explore its value in early differented diagnosis and in prediction of disease severity of RA. MethodsPlasma, peripheral blood mononuclear cell(PBMCs) and synovial fluid were taken from patients with RA and osteoarthritis(OA).The expression level of miR-16 was detected by stem-loop real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction(stem-loop FQ-PCR) with SYBR GreenⅠdye, and using U6snRNA as endogenous control. ResultsBoth of the amplication curves and the dissociation curves of miR-16 and U6snRNA were running well. No primer dimmers were formed, and the products of PCR were specific. The expression level of miR-16 in plasma was higher than those in synovial fluid and PBMCs, respectively(P<0.01). The expression level of miR-16 in PBMCs was higher for RA patients than for healthy controls(P<0.01)， the level in synovial fluid was higher for RA patients than for OA patients(P<0.01). The expression level of miR-16 in plasma was inversely correlated with the Disease Activity Score(DAS28)(P<0.05), but was not correlated with erythrocyte sedimentation rate(ESR) and C-reactive protein(CRP). the miR-16 level in PBMCs was positively correlated with DAS28, ESR and CRP(P<0.05). The miR-16 level in synovial fluid had no correlations with DAS28, ESR and CRP(P>0.05). ConclusionStem-loop FQ-PCR with SYBR Green Ⅰdye was a sensitive and specific method for the quantitative detection of miRNAs. There were distinct profiles in plasma and synovial fluid,and the expression level of miR-16 in synovial fluid can be a marker for differential diagnosis of RA and OA. The expression level of plasma miR-16 can serve as an effective novel indicator on assessment of the clinical disease activity.

[Key words]arthritis， rheumatoid; synovial fluid; microRNAs

[中圖分類號(hào)]R593.22

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2016)03-0296-05

[作者簡(jiǎn)介]馮忠軍(1968-)，男，河北泊頭人，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院主任技師，醫(yī)學(xué)碩士，從事臨床檢驗(yàn)學(xué)研究。

[收稿日期]2014-11-19；[修回日期]2014-12-28