張　新，王超英(.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院眼科，河北 石家莊 05003；.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院眼科，河北 石家莊 05008)

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·論著·

透鏡誘導豚鼠近視眼超微結構的觀察

張新1，王超英2(1.河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050031；2.中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院眼科，河北 石家莊 050082)

[摘要]目的觀察豚鼠實驗性近視眼組織超微結構的改變，探索近視發(fā)病機制。方法選用出生后2周齡的豚鼠39只，隨機分為A、B、C 3組，每組13只，選取任意一眼戴-10.00 DS凹透鏡,分別于10、30、50 d后去除鏡片，驗光，測眼球長度，摘除眼球行光鏡電鏡檢查。結果誘導后實驗眼和對照眼均出現(xiàn)近視，眼軸增長，與誘導前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且隨時間延長，眼屈光度、眼軸變化越嚴重(P<0.05)。實驗眼眼屈光度低于對照眼，眼軸長于對照眼(P<0.05)。實驗眼3組間鞏膜厚度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，C組鞏膜厚度較A組薄(P<0.05)。C組實驗眼鞏膜厚度較對照眼薄(P<0.05)。A組鞏膜膠原纖維排列稍紊亂。B組鞏膜膠原纖維排列稍紊亂、粗細不均、間隙變大。C組鞏膜膠原纖維排列紊亂、粗細不均、間隙變大，膠原纖維板層結構不清，局部纖維母細胞增生。C組視網(wǎng)膜外核層細胞核變小、變圓，排列不均，視細胞層外節(jié)、內(nèi)節(jié)排列紊亂。結論豚鼠可作為研究實驗性近視的一種經(jīng)濟有效的哺乳類模型動物。實驗性近視眼的鞏膜、視網(wǎng)膜均發(fā)生了一系列的退行性改變。

[關鍵詞]近視；透鏡；超微結構；豚鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2016.03.008

近視的發(fā)病機制迄今尚未明了。近視眼動物模型為研究近視眼的發(fā)生原因和近視化過程提供了極有價值的途徑。本實驗用凹透鏡誘導的方法制成豚鼠的近視模型，檢測其屈光狀態(tài)、眼軸長度，并觀測其超微結構的改變，旨在為探討近視進展的病理因素及進一步防治打下基礎。報告如下。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組2周齡已脫離母乳喂養(yǎng)的小豚鼠39只，無眼部疾患，雌雄不限，由河北省實驗動物中心提供，隨機分為A(10 d)、B(30 d)、C(50 d)3組，每組13只。每只動物隨機選擇一眼為實驗眼，另一眼為自身對照。幼豚鼠于室內(nèi)標準化喂養(yǎng)，白天用自然光照射，每日光照與黑暗的周期比例為14∶10，室溫控制在20 ℃。

1.2凹透鏡片自行設計的PMMA鏡片，部分參數(shù)如下：鏡片直徑13.5 mm，光學直徑10.5 mm，基弧為9.61，屈光度均為-10.00 DS[1]。

1.3方法將豚鼠標記編號，雙眼結膜囊滴1%托吡卡胺滴眼液3次，每次間隔10 min，帶狀光檢影驗光；股部肌內(nèi)注射鹽酸氯胺酮(50 mg/kg)致全身麻醉，用A超測量雙眼球眼軸長度。測量以手動模式連續(xù)測量10次，計算平均值，精確到0.01 mm。隨機選擇一眼為實驗眼，另一眼為自身對照，在全身麻醉狀態(tài)下，無菌操作，將鏡片固定于豚鼠眼前(鏡片縫合至內(nèi)、外眥皮膚)。實驗期間注意隨時清潔鏡片，盡量減少鏡片不潔造成的形覺剝奪效應。將上述豚鼠于室內(nèi)標準化喂養(yǎng)，10、30、50 d后摘除實驗鏡片，按前述方法再次行雙眼睫狀肌麻痹檢影驗光和A超測量眼軸[2]。處死豚鼠，每組取2只豚鼠眼球放入4%戊二醛溶液中固定。其余眼球行光鏡觀察。

1.4光鏡觀察標本置于眼球固定液中48 h后，經(jīng)各級酒精脫水，石蠟浸透包埋切片，HE染色，光鏡觀察眼球壁的各層組織結構及測量鞏膜厚度。

1.5電鏡觀察取眼球后極部眼球壁切成>1 mm大小組織塊4%戊二醛溶液中固定，1%鋨酸后固定，各級酒精及丙酮脫水，浸透包埋，固化，超薄切片，醋酸鈾、檸檬酸鉛雙重染色，透射電鏡觀察。

1.6盲法處理檢影驗光及所有測量均由另一位專業(yè)人員操作，操作人員不知被檢眼是實驗眼還是對照眼。

1.7統(tǒng)計學方法應用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較分別采用t檢驗、配對t檢驗、F檢驗和q檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.1豚鼠實驗性近視的誘導結果誘導前3組實驗眼和對照眼屈光度、眼軸長度比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；誘導后實驗眼和對照眼均出現(xiàn)近視，眼軸增長，與誘導前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且隨時間延長，眼屈光度、眼軸變化越嚴重，3組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。實驗眼屈光度低于對照眼，眼軸長于對照眼，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。

表1豚鼠凹透鏡誘導前后雙眼屈光度及眼軸長度變化

Table 1Refraction and axial of guinea pig eyes before

and after monocularly Lens-inducing

組別實驗眼屈光度(D)誘導前誘導后對照眼屈光度(D)誘導前誘導后A組+3.54±1.11-1.94±0.81*☆+3.96±1.69+2.87±0.83*B組+3.33±0.87-3.78±1.04*#☆+3.17±0.98+1.58±0.82*#C組+2.58±0.73-6.38±0.59*#△☆+2.90±0.78+1.27±1.44*#F3.17593.0513.19811.495P0.0620.0000.0610.001組別實驗眼眼軸長度(mm)誘導前誘導后對照眼眼軸長度(mm)誘導前誘導后A組7.71±0.138.24±0.17*☆7.72±0.177.98±0.30*B組7.54±0.358.41±0.38*☆7.58±0.268.02±0.21*C組7.47±0.239.49±0.81*#△☆7.44±0.298.45±0.29*#△F3.03521.6133.00412.136P0.0700.0000.0710.001

*P<0.05與誘導前比較(配對t檢驗)#P<0.05與A組比較△P<0.05與B組比較(q檢驗)☆P<0.05與對照眼比較(t檢驗)

2.2鞏膜厚度比較對照眼3組間鞏膜厚度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，實驗眼3組間鞏膜厚度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，C組鞏膜厚度較A組薄，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。A組和B組實驗眼與對照眼鞏膜厚度比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，C組實驗眼鞏膜厚度較對照眼薄，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。

表23組實驗眼與對照眼鞏膜厚度比較

Table 2Comparison of thickness of scleral in induced

eye and control eye three groups

組別鞏膜厚度實驗眼對照眼tPA0.35±0.030.35±0.020.0001.000B0.34±0.030.36±0.031.7000.102C0.32±0.03*0.37±0.025.0000.000F3.3702.294P0.0460.115

*P<0.05與A組比較(q檢驗)

2.3光鏡觀察結果鞏膜：A組 (10 d)除鞏膜膠原纖維排列稍紊亂外，未見其他表現(xiàn)(圖1)；B組(30 d)鞏膜膠原纖維排列稍紊亂、粗細不均、間隙變大(圖2)；C組(50 d)鞏膜變化較明顯，可見鞏膜膠原纖維排列紊亂、粗細不均、間隙變大，可見膠原纖維板層結構不清，局部可見纖維母細胞增生(圖3)。脈絡膜:未發(fā)現(xiàn)明顯變化。視網(wǎng)膜： A組(10 d)、B組(30 d)均未見明顯變化；C組(50 d)視網(wǎng)膜外核層細胞核變小、變圓，排列不均，視細胞層外節(jié)、內(nèi)節(jié)排列紊亂(圖4)。

2.4電鏡觀察結果鞏膜：A組(10 d)鞏膜膠原纖維排列稍紊亂(圖5)；B組(30 d)膠原纖維排列中度紊亂，粗細不均(圖6)；C組(50 d) 膠原纖維排列重度紊亂，粗細不均，間隙變大。粗面內(nèi)質網(wǎng)擴張(圖7)。視網(wǎng)膜：與對照眼比較, A組(10 d)組視網(wǎng)膜色素上皮細胞(retinal pigment epithelium,RPE)絨毛樣突起減少，排列紊亂(圖8)；B組(30 d)視網(wǎng)膜RPE絨毛樣突起稀疏變短，排列紊亂，視細胞外節(jié)盤膜間隙大小不一(圖9)；C組(50 d)視網(wǎng)膜RPE長突起消失融合，部分盤膜連續(xù)性中斷、破壞(圖10)。

圖1 A組豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡膜、鞏膜(HE×200)

Figure1 Retina,choroidsandscleraofguieapigmyopiceyeingroupA(HE×200)

圖2 B組豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡膜、鞏膜(HE×200)

Figure2 Retina,choroidsandscleraofguieapigmyopiceyeingroupB(HE×200)

圖3 C組豚鼠視網(wǎng)膜、脈絡膜、鞏膜(HE×200)

Figure 3Retina, choroids and sclera of guiea pig myopic eye in group C (HE ×200)

圖4C組豚鼠視網(wǎng)膜(HE ×200)

Figure 4Retina of guiea pig myopic eye in group C (HE ×400)

圖5A組豚鼠鞏膜膠原纖維電鏡下結果(×20 000)

Figure 5Collagen fibers of guinea pig myopic eye in group A TEM(×20 000)

圖6B組豚鼠鞏膜膠原纖維電鏡下結果(×20 000)

Figure 6Collagen fibers of guinea pig myopic eye in group B TEM(×20 000)

圖7C組豚鼠鞏膜膠原纖維電鏡下結果(×20 000)

Figure 7Collagen fibers of guinea pig myopic eye in group C TEM(×20 000)

圖8A組豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮微絨毛和盤膜電鏡結果(×20 000)

Figure 8Brush-like of RPE cell and membrane disk of myopic eye in group A TEM(×20 000)

圖9B組豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮微絨毛和盤膜電鏡結果(×20 000)

Figure 9Brush-like of RPE cell and membrane disk of myopic eye in group B TEM(×20 000)

圖10C組豚鼠視網(wǎng)膜色素上皮微絨毛和盤膜電鏡結果(×20 000)

Figure 10Brush-like of RPE cell and membrane disk of myopic eye in group C TEM(×20 000)

3討論

近視眼動物模型為研究近視眼的發(fā)生原因和近視化過程提供了極有價值的途徑。有學者認為，形覺剝奪性近視和離焦性近視的病理變化并沒有明顯不同[3]，但大多數(shù)學者認為離焦誘導性近視更接近人類青少年近視的發(fā)生，主要是光感受器接受離焦光線的信號刺激后，啟動局部視網(wǎng)膜生長調節(jié)通路，通過視網(wǎng)膜、脈絡膜級聯(lián)放大效應最終引起靶組織鞏膜的改變和眼軸的延長，近視得以發(fā)生發(fā)展[4]。本研究以幼豚鼠(2周齡)為實驗對象，采用凹透鏡誘導的方法，分別在10、30、50 d內(nèi)均誘導出了近視，成功建立了實驗性近視的動物模型。說明此期豚鼠眼對透鏡去焦是敏感的。誘導后對照眼亦出現(xiàn)遠視度數(shù)降低、眼軸的延長，與誘導前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)； 3組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。幼年豚鼠的眼軸均處于遠視狀態(tài)，眼軸的發(fā)育是一個由遠視狀態(tài)向近視發(fā)展的過程，在沒有外界因素的干擾下，眼軸也會隨年齡增長而增長，與人眼的發(fā)育狀態(tài)相一致。豚鼠性情溫順，具有生長發(fā)育期較短、方便飼養(yǎng)、易于檢查等特點。豚鼠眼解剖結構、生理功能與人眼相似，且史劍波等[5]通過計算機圖像分析系統(tǒng)對正常豚鼠視網(wǎng)膜結構進行的定量分析表明豚鼠具有較好的視力。因此，豚鼠可作為透鏡誘導性近視研究的一種經(jīng)濟有效的模型哺乳動物。

3.1鞏膜組織學改變及超微結構改變實驗性近視眼的突出表現(xiàn)就是眼軸延長，本研究用凹透鏡誘導10、30、50 d后，實驗眼出現(xiàn)眼軸增長，與誘導前比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；且隨時間延長，眼軸越長，3組間差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。近視性眼底病變與眼軸過度延長關系密切， 已被眾多學者所證實[6]。這種眼軸的延長是鞏膜重新塑形的結果，伴有鞏膜的病理學改變。關國華等[7]證實，近視眼鞏膜硬度 E 值明顯下降， 鞏膜的彈性模量、 最大載荷及最大應力均明顯下降， 最大應變力增高。有研究顯示，在哺乳動物實驗性近視眼中， 鞏膜成纖維細胞生長抑制， 有絲分裂活性降低，膠原纖維合成代謝減少、 分解代謝增加， 這些改變最終引起膠原纖維直徑變小， 鞏膜進行性變薄， 導致眼軸延長及近視形成[8]。豚鼠等哺乳動物的鞏膜主要由膠原纖維、成纖維細胞和細胞外基質構成。豚鼠形成近視眼時，后極部鞏膜膠原優(yōu)先受影響，由于后極部鞏膜膠原減少，減弱了鞏膜的抵抗力，使眼軸易于延展，從而發(fā)生近視。透鏡誘導可以通過局部視網(wǎng)膜機制來調控鄰近鞏膜生長，視覺信號通過某些途徑轉變?yōu)檎{控鞏膜重塑的信號，鞏膜重塑不會導致鞏膜組織的凈增長，但改變了鞏膜組織的機械特性，降低了鞏膜對正常眼壓的抵抗力，引起眼球擴張和近視屈光度增加，從而導致眼軸延長， 產(chǎn)生軸性近視[9]。本研究光電鏡發(fā)現(xiàn)豚鼠實驗眼的鞏膜膠原纖維排列紊亂、粗細不均，纖維間隙變大，可見膠原纖維走向不一、板層結構不清，局部可見纖維母細胞增生，這種變化以C組最為明顯。鞏膜的病理改變與生物力學特性改變相關。本研究通過生物測量鞏膜厚度發(fā)現(xiàn)C組實驗眼鞏膜厚度較對照眼薄(P<0.05)；實驗眼3組間鞏膜厚度比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，C組鞏膜厚度較A組薄，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；C組實驗眼鞏膜纖維細胞內(nèi)出現(xiàn)了粗面內(nèi)質網(wǎng)的擴張。粗面內(nèi)質網(wǎng)擴張是細胞變性基本特點之一。隨著誘導時間的延長，鞏膜變薄，膠原纖維斷裂，纖維細胞出現(xiàn)變性、水腫，出現(xiàn)纖維母細胞活化、分裂、增生，成為纖維細胞以修復局部變性的膠原纖維。陳博宇等[2]研究表明，鞏膜成纖維細胞在轉化生長因子β2的影響下，表現(xiàn)為細胞核外形不規(guī)則，胞質水腫，胞漿內(nèi)線粒體較多而小，部分線粒體水腫，粗面內(nèi)質網(wǎng)擴張，內(nèi)質網(wǎng)及核糖體等細胞器均減少， 細胞界膜不清，部分界膜消失。丁雯芝等[10]研究發(fā)現(xiàn)，豚鼠形覺剝奪超高度近視眼的視網(wǎng)膜、脈絡膜和鞏膜厚度較對照組明顯變薄，結構也發(fā)生紊亂。形覺剝奪超高度近視眼鞏膜結構疏松，膠原纖維部分分離斷裂，細胞外基質增多，脈絡膜血管層松散稀疏不規(guī)則，毛細血管密度減低，眼軸增長和近視產(chǎn)生與鞏膜的主動重塑和被動延伸以及脈絡膜萎縮血流量減少密切相關。近視眼鞏膜的硬度下降，應變力增大，鞏膜在眼內(nèi)壓的作用下被動擴張，從而引起眼軸不斷延長[11]。實驗性近視眼的鞏膜彈性差，易變性，具有較低的承載能力[12]?？傊?，膠原纖維的退行性改變減弱了其抗牽拉的特性，其最終的結果是導致不可逆的眼軸的延長。

3.2視網(wǎng)膜的組織學改變及超微結構正常視網(wǎng)膜色素上皮頂端的細長突起似微絨毛，它們以薄片狀套進視錐、視桿細胞外段的遠端。眼軸的延長還可能導致脈絡膜的血管拉伸、退行性改變、血-視網(wǎng)膜屏障、視網(wǎng)膜-脈絡膜屏障功能破壞，從而導致脈絡膜、 視網(wǎng)膜的變性和萎縮，在光鏡下可見后極部視網(wǎng)膜厚度明顯變薄， 這可能是近視眼眼底病變的形成及其并發(fā)癥產(chǎn)生的病理基礎[13]。本研究通過光電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，對照眼視網(wǎng)膜RPE伸出長絨毛樣突起，整齊密集，這些突起在視細胞外段伸展，并部分包裹著外段；而實驗眼視網(wǎng)膜外核層細胞核變小、變圓，排列不均，視網(wǎng)膜RPE向內(nèi)伸出的微絨毛減少、斷裂，甚至融合消失，視細胞層排列紊亂，膜盤間隙大小不一，部分盤膜連續(xù)性中斷、破壞。正常視細胞的代謝是靠內(nèi)、外節(jié)連接處的盤膜不斷生成和視細胞頂端舊的盤膜不斷脫落成碎片，并被視網(wǎng)膜RPE不斷吞噬完成的。配戴負鏡引起視網(wǎng)膜上模糊成像，使視網(wǎng)膜細胞活動異常，影響視細胞外節(jié)盤膜的脫落和(或)RPE吞噬功能，從而改變了視細胞的代謝水平，引起視網(wǎng)膜的一系列病理改變，文丹等[14]研究發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜盤膜有不同程度的水腫和脫落，線粒體腫脹、變形及空泡樣改變，染色體邊聚等細胞凋亡特征，其認為異常光信號是近視形成的外界因素，它投射至視網(wǎng)膜后可能通過光傳導信使環(huán)鳥苷酸傳遞視覺信號,并通過一定的視網(wǎng)膜傳導通路傳至鞏膜效應器以調控眼球生長，參與近視形成。隨著眼軸長度增加，視網(wǎng)膜厚度變薄[15]。在近視誘導過程中，視網(wǎng)膜出現(xiàn)的一系列病理改變，影響了視網(wǎng)膜的正常功能活動，最終作用于鞏膜，引起眼軸延長。

眼球的生長發(fā)育是一個錯綜復雜的過程，可能受多種因素的調控，視網(wǎng)膜視覺信息如何轉變?yōu)檎{節(jié)鞏膜生長信號，是近視眼研究的關鍵問題，還需進一步探討。

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(本文編輯：趙麗潔)

Observation on ultrastructure of lens-induced myopia in guinea pig

ZHANG Xin1， WANG Chao-ying2

(1. Department of Ophthalmology， the First Hospital of Hebei Medical University，Shijiazhuang 050031, China； 2.Department of Ophthalmology， the Bethune International Peace Hospital, Shijiazhuang 050082, China)

[Abstract]ObjectiveTo study the ultrastructure changes of myopia induced by lens-induced method and to explore its pathological mechanism. MethodsThirty-nine guinea pigs with two weeks old were randomly divided into three groups:group A, group B and group C, with thirteen rats in each group. A eye was randomly selected to wear -10. 00 DS concave lens, which was removed after culturing for 10 days, 30 days and 50 days in group A, group B and group C, respectively .Two-week-old guinea pigs were lens-induced monocularly. At day 10，day 30 and day 50, the lens were removed respectively. After measurement of referaction and axial length,eyeballs were removed and the eyes were observed by light and electronmicroscope. ResultsAfter the experiment, the exprerimental eyes and the control eyes were induced myopia, the growth of the eye axis, the difference was statistically significant(P<0.05). And with the time prolonged, the more severe the eyes, the more serious the axial length(P<0.05) . The refractive degree of the experimental eye was lower than that of the control, and the axial length was longer than that of the control eye(P<0.05). There were significant differences among the 3 groups in the scleral thickness(P<0.05). The thickness of group C was thinner than that of group A(P<0.05). Compared with the control eyes, the scleral thickness in group C was thinner than that in control group(P<0.05). The collagen fibers in the group A were slightly disordered. The arrangement of collagen fibers in group B were slightly disordered, thickness was uneven, and gaps became larger. In group C, the disorder of collagen fibers and uneven thickness of the collagen fibers were increased, and the structure of collagen fibers was not clear. In group C, the outer nuclear layer of the retina became smaller and round, and arrangement was disordered. ConclusionThe guinea pig can be used as an effective and economical manmmal model in experimental myopia study. The degenerations were occurred in sclera and retina in the experimental models.

[Key words]myopia； lenses； ultrastructure； guinea pigs

[中圖分類號]R778.11

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2016)03-0275-05

[作者簡介]張新(1978-)，女，河北衡水人，河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院主治醫(yī)師,醫(yī)學碩士，從事眼科疾病診治研究。

[收稿日期]2015-09-08；[修回日期]2015-10-13