潘紅艷，郭啟雷，史海良，楊紅梅（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

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食品中甲醛殘留量高通量檢測(cè)方法研究

潘紅艷，郭啟雷，史海良，楊紅梅
（國(guó)家食品質(zhì)量安全監(jiān)督檢驗(yàn)中心，北京100094）

摘要：建立食品中甲醛殘留量的高通量快速檢測(cè)方法。樣品中的甲醛在酸性條件下與2，4-二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，經(jīng)高效液相色譜紫外檢測(cè)器檢測(cè)，流動(dòng)相乙腈∶水（6∶4，體積比），流速1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)355 nm。該方法在0.05 μg/mL～5.0 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線(xiàn)性關(guān)系良好（R2＝0.999 9），檢出限為0.5 mg/kg，加標(biāo)回收率為80.2 %～107.7 %。該方法操作簡(jiǎn)便、快速、實(shí)用性廣，可為面粉、粉條、蝦皮、竹筍、腐竹、魚(yú)類(lèi)（魷魚(yú)、鯽魚(yú)等）、血豆腐等多種食品基質(zhì)中甲醛殘留量的檢測(cè)提供參考。

關(guān)鍵詞：甲醛；高效液相色譜；食品

甲醛是一種原生質(zhì)毒素，可嚴(yán)重危害人體細(xì)胞、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、皮膚和粘膜，甲醛慢性中毒可導(dǎo)致器官癌變，急性中毒會(huì)導(dǎo)致腹瀉、腹痛、嘔吐和頭暈等癥狀[1]。食品中甲醛的來(lái)源比較復(fù)雜，一是人為添加，不法商販常將甲醛添加到食品中，用于防腐、保鮮、漂白等作用，如食品加工中的“吊白塊”，水產(chǎn)品保鮮中的“福爾馬林”；二是食品本身含有，如某些香菇產(chǎn)品中含有大量甲醛[2]，凍鱈魚(yú)等水產(chǎn)品自身代謝產(chǎn)生少量甲醛[3]；三是生產(chǎn)加工過(guò)程中受到包裝容器等的污染；四是食品配料中含有的甲醛。

由于食品化學(xué)成分較復(fù)雜，影響因素較多，因此甲醛殘留量的測(cè)定受到食品基體成份的干擾較大[4]。目前甲醛的測(cè)定方法有分光光度法、氣相色譜法、高效液相色譜法等[5-8]。李光等[4]用吊白塊在酸性條件下分解出甲醛和二氧化硫等化合物，將蒸餾液用蒸餾水吸收，用顯色劑變色酸或乙酰丙酮與蒸餾液中的甲醛反應(yīng)，對(duì)某些食品同時(shí)測(cè)定蒸餾液中的二氧化硫和甲醛。此方法耗費(fèi)時(shí)間較長(zhǎng)，不利于大量樣品的處理。隋雪燕等[9]采用2，4-二硝基苯肼衍生，環(huán)己烷提取，用電子捕獲檢測(cè)器氣相色譜法測(cè)定，建立了測(cè)定紡織品中游離甲醛的衍生氣相色譜法，此方法適用范圍較窄，在實(shí)際市場(chǎng)監(jiān)督中往往涉及多種基質(zhì)。陳笑梅等[10]研究了直接用于液相色譜測(cè)定甲醛與2，4 -二硝基苯肼的反應(yīng)條件，使反應(yīng)在弱酸性和50 %的乙腈條件下進(jìn)行，反應(yīng)產(chǎn)物甲醛衍生物不需要有機(jī)溶劑萃取，可直接用于液相色譜分析，避免了萃取過(guò)程的損失。

雖然目前在甲醛殘留量檢測(cè)方面的研究較多，現(xiàn)行檢測(cè)甲醛的標(biāo)準(zhǔn)有地方標(biāo)準(zhǔn)、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)、出入境標(biāo)準(zhǔn)等[11-15]，參考標(biāo)準(zhǔn)種類(lèi)繁多。文章對(duì)現(xiàn)行參考標(biāo)準(zhǔn)中檢測(cè)方法進(jìn)行比較和優(yōu)化，建立了一個(gè)適用性廣，簡(jiǎn)便快速的高通量甲醛檢測(cè)方法。

1　材料與方法

乙腈、正己烷（色譜純），乙酸鈉，冰乙酸，氯化鈉，磷酸氫二鈉，37 %鹽酸，2，4-二硝基苯肼：純度≥95 %北京市興津化工廠。

Agilent1200高效液相色譜儀（配有二極管陣列檢測(cè)器）：安捷倫公司；恒溫水浴振蕩器：上海申能博彩生物科技有限公司；Milli-Q純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司；電子天平感量（0.000 1 g、0.01 g）：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；HY-5回旋振蕩器：國(guó)華電器有限公司；微孔濾膜0.22 μm，有機(jī)相津騰。

1.1試劑配制

衍生液1：稱(chēng)取25 mg 2，4-二硝基苯肼溶于6 mL 37 %鹽酸，加水定容至25 mL。

衍生液2：（乙酸鈉緩沖溶液，pH＝5）為稱(chēng)取3.64 g乙酸鈉，以適量水溶解，加入1.0 mL冰乙酸，用水定容至500 mL。2，4-二硝基苯肼溶液（0.6 g/L）為稱(chēng)取2，4-二硝基苯肼300 mg，用乙腈溶解定容至500 mL。量取100 mL乙酸鈉緩沖溶液和100 mL 2，4-二硝基苯肼溶液混勻，配制成衍生液2。

衍生液3：稱(chēng)取50 mg 2，4-二硝基苯肼，乙腈定容至25 mL。

鹽酸-氯化鈉溶液：稱(chēng)取2g氯化鈉于100mL容量瓶中，用少量水溶解，加6mL37%鹽酸，加水定容至刻度。

磷酸氫二鈉溶液：稱(chēng)取18 g Na2HPO4·12 H2O，加水定容至100 mL。

甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：取1 mL 36 %～38 %甲醛溶液，用水定容至500 mL，使用前按GB/T 2912.1-1998中的亞硫酸鈉法標(biāo)定甲醛濃度。此溶液于棕色瓶中4℃冰箱中保存，一個(gè)月內(nèi)穩(wěn)定。準(zhǔn)確量取一定量經(jīng)標(biāo)定的甲醛標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配制成50 μg/mL的甲醛標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，此溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2樣品處理

試樣選取可食用部分經(jīng)粉碎機(jī)充分粉碎并混合均勻，面粉、粉絲、腐竹等試樣在0℃～4℃冷藏，蝦皮、竹筍、魚(yú)類(lèi)、血豆腐等在-18℃以下保存。

稱(chēng)取均勻粉碎的試樣2.0 g（準(zhǔn)確至0.01 g），置于50 mL三角瓶中，準(zhǔn)確加入20.0 mL衍生液2。蓋上塞子，渦旋混勻后置于60℃恒溫振蕩器中150 r/min振搖1 h，取出冷卻至室溫。取上層清液過(guò)0.22 μm濾膜上機(jī)測(cè)定。

若試樣中脂肪含量較高，取上述提取液10 mL于50 mL塑料離心管中，加入5 mL乙腈飽和的正己烷溶液，渦旋混合，離心后棄去上清液，取下層溶液過(guò)0.22μm濾膜上機(jī)測(cè)定。

1.3甲醛衍生物標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

移取0、10、20、100、200、400 μL甲醛應(yīng)用液（50 μg/mL），置于10 mL具塞刻度管中，用衍生液2定容至10 mL，蓋上塞子后搖勻，60℃水浴加熱1 h，取出冷卻至室溫。過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。

1.4儀器條件

色譜柱：Agilent C18柱，250 mm×4.6 mm，5 μm；流動(dòng)相：乙腈∶水為（60∶40，體積比）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：355 nm；進(jìn)樣量：20 μL

2　結(jié)果與討論

2.1方法對(duì)比

2.1.1衍生液比較

比較3種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中不同衍生條件對(duì)測(cè)定結(jié)果的影響。涉及的檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為：SC/T 3025-2006《水產(chǎn)品中甲醛的測(cè)定》；SN/T 1547-2011《進(jìn)出口食品中甲醛的測(cè)定液相色譜法》；GB/T 21126-2007《小麥粉與大米粉及其制品中甲醛次硫酸氫鈉含量的測(cè)定》。

取一定量甲醛應(yīng)用液于10 mL具塞刻度管中，分別按3種檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)的衍生方法在同一溫度下衍生相同時(shí)間。

2.1.1.1 SC/T 3025-2006《水產(chǎn)品中甲醛的測(cè)定》

取0.5 mL甲醛應(yīng)用液于10 mL具塞刻度管中，加入0.2 mL衍生液1，加水定容至10 mL，渦旋混勻后60℃水浴30 min。取出冷卻至室溫，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。

2.1.1.2 SN/T 1547-2011《進(jìn)出口食品中甲醛的測(cè)定液相色譜法》

取0.5 mL甲醛應(yīng)用液于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，渦旋混勻后60℃水浴30 min。取出冷卻至室溫，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。2.1.1.3 GB/T 21126-2007《小麥粉與大米粉及其制品中甲醛次硫酸氫鈉含量的測(cè)定》

取0.5 mL甲醛應(yīng)用液于10 mL具塞刻度管中，加入2 mL鹽酸氯化鈉，1 mL磷酸氫二鈉，0.5 mL衍生液3，加水定容至10mL。渦旋混勻后60℃水浴30 min。取出冷卻至室溫，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。

比較不同衍生液在同一衍生條件下產(chǎn)生的甲醛衍生物的峰面積，比較結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1不同衍生液比較Fig.1 Different derived liquid comparison

圖2衍生溫度比較Fig.2 Derived temperature comparison

由圖1可見(jiàn)，2號(hào)衍生液和3號(hào)衍生液的衍生效果相當(dāng)，其中以2號(hào)效果最佳，乙腈和2，4-二硝基苯肼的含量均對(duì)衍生效果產(chǎn)生一定影響，陳笑梅[10]等的研究也說(shuō)明乙腈含量在20 %～70 %之間對(duì)衍生反應(yīng)有較好的作用。當(dāng)樣品中含有較高的甲醛時(shí)，也需要有充分的2，4-二硝基苯肼與其發(fā)生反應(yīng)，因此選取SN/T 1547-2011《進(jìn)出口食品中甲醛的測(cè)定液相色譜法》中的衍生液進(jìn)行進(jìn)一步衍生條件的優(yōu)化。

2.1.2衍生溫度選擇

取甲醛應(yīng)用液0.5 mL于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，渦旋混勻后分別置于恒溫水浴鍋中衍生30 min，取出冷卻至室溫，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。根據(jù)3個(gè)不同標(biāo)準(zhǔn)給出的不同衍生溫度，選取40、50、60、70℃4個(gè)溫度進(jìn)行比較，分析其對(duì)甲醛衍生物的峰面積的影響，比較結(jié)果見(jiàn)圖2。

由圖2可見(jiàn)，在溫度為60℃時(shí)，甲醛衍生物的峰面積最高，溫度有助于衍生反應(yīng)的進(jìn)行，而溫度過(guò)高可能會(huì)導(dǎo)致衍生物的不穩(wěn)定。因此實(shí)驗(yàn)選取60℃為最佳衍生溫度。

2.1.3衍生時(shí)間選擇

取甲醛應(yīng)用液0.5 mL于10 mL具塞刻度管中，加衍生液2定容至10 mL，渦旋混勻后60℃水浴，過(guò)0.22 μm濾膜，濾液供HPLC測(cè)定。同時(shí)選取四種基質(zhì)（腐竹、血豆腐、蝦皮、面粉）加入適量甲醛應(yīng)用液，分析基質(zhì)干擾對(duì)衍生時(shí)間的影響。根據(jù)3種不同標(biāo)準(zhǔn)給出的衍生時(shí)間，分別測(cè)定衍生10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 min后所生成衍生物的峰面積。比較結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3衍生時(shí)間比較Fig.3 Derived time comparison

由圖3可見(jiàn)，甲醛應(yīng)用液在水浴30 min時(shí)刻達(dá)到最高峰面積，隨著衍生時(shí)間的繼續(xù)增加，峰面積有所降低并趨于穩(wěn)定。腐竹、血豆腐、蝦皮、面粉的最佳衍生時(shí)間分別是60、60、70、70 min，蝦皮在60 min之后的衍生效果并沒(méi)有顯著性變化，由此看出不同樣品基質(zhì)的存在會(huì)對(duì)衍生過(guò)程起到一定程度的影響，綜合各種不同基質(zhì)，試驗(yàn)最終選取60℃水浴60 min為合理衍生時(shí)間。

2.1.4色譜條件優(yōu)化

經(jīng)二極管陣列檢測(cè)器的波長(zhǎng)掃描，甲醛衍生物2，4-二硝基苯腙的吸收?qǐng)D譜見(jiàn)圖4，根據(jù)此圖譜試驗(yàn)最終選取檢測(cè)波長(zhǎng)為355 nm。

圖4甲醛衍生物吸收?qǐng)D譜Fig.4 Absorption spectrum of formaldehyde derivatives

對(duì)比了乙腈與水的體積比比例在70∶30、60∶40、 50∶50分別在0.8 mL/min和1.0 mL/min的流速下甲醛衍生物的色譜峰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明乙腈與水的體積比在60∶40，流速為1.0 mL/min時(shí)，色譜峰的保留時(shí)間和分離效果最好，并不受基質(zhì)中的雜峰干擾，色譜如圖5所示。

圖5甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物色譜圖Fig.5 Chromatogram of formaldehyde derivative

2.2線(xiàn)性關(guān)系和檢出限

在本方法最終確定的條件下對(duì)甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，甲醛濃度在0.05 μg/mL～5.0 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線(xiàn)性關(guān)系，線(xiàn)性方程為y＝745.27x - 1.262，相關(guān)系數(shù)R2＝0.999 9。樣品檢出限為0.5 mg/kg。

由于空氣、試劑等中均有微量甲醛殘留，因此在試驗(yàn)中需進(jìn)行空白試驗(yàn)，除不加試樣外，其他過(guò)程均按1.3步驟進(jìn)行處理。結(jié)果計(jì)算時(shí)需扣除空白。

2.3方法回收率和精密度

對(duì)面粉、粉條、蝦皮、竹筍、腐竹、鯽魚(yú)、血豆腐樣品進(jìn)行基質(zhì)加標(biāo)試驗(yàn)，按試驗(yàn)最終選定的方法步驟進(jìn)行，平行測(cè)定5次，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1方法回收率和精密度（n=5）Table 1 The recovery and precision of the method

由表1可知，分別在樣品中加入0.5、1.0、5.0 mg/kg的甲醛標(biāo)準(zhǔn)溶液，得到的回收率在80.21 %～107.66 %之間，方法回收率較好，可實(shí)現(xiàn)對(duì)食品中甲醛殘留量的快速檢測(cè)。

3　結(jié)論

建立了食品中甲醛殘留量的快速測(cè)定方法，實(shí)現(xiàn)在同一時(shí)間對(duì)多個(gè)樣品的批量處理。在酸性條件下，樣品中殘留的甲醛與2，4-二硝基苯肼發(fā)生加成反應(yīng)，生成黃色的2，4-二硝基苯腙，提取液在355 nm波長(zhǎng)下，經(jīng)液相色譜法（HPLC）測(cè)定，外標(biāo)法定量。此方法適用于面粉、粉條、蝦皮、竹筍、腐竹、魚(yú)類(lèi)（魷魚(yú)、鯽魚(yú)等）、血豆腐等多種食品基質(zhì)中甲醛殘留量的鑒別及檢測(cè)。方法快速簡(jiǎn)便，靈敏度高，重現(xiàn)性好?？蓾M(mǎn)足對(duì)多種食品中甲醛含量的準(zhǔn)確測(cè)定。

參考文獻(xiàn)：

[1]徐天源,林太清,韓必紅.水產(chǎn)及水發(fā)食品中甲醛的氣相色譜法測(cè)定[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2005,15(1):64-65

[2]李綺,邢志強(qiáng),李瑩,等.保鮮香菇中甲醛含量的分析研究[J].遼寧大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2004,31(2): 105

[3]馬敬軍,周德慶,張雙靈.水產(chǎn)品中甲醛本底含量與產(chǎn)生機(jī)理的研究進(jìn)展[J].海洋水產(chǎn)研究,2004,25(4): 85

[4]李光,趙建民,高中燦,等.食品中甲醛合次硫酸氫鈉的測(cè)定方法探討[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16(10):1261-1263

[5]馬海霞,李來(lái)好,楊賢慶,等.分光光度法測(cè)定水產(chǎn)品中甲醛含量的研究[J].南方水產(chǎn),2008,4(6):26-32

[6]黃惠玲,何鶯,王玉健,等.氣相色譜法測(cè)定食品包裝材料中微量甲醛[J].分析實(shí)驗(yàn)室,2009,28(z1):203-205

[7]陳銘學(xué),牟仁祥,應(yīng)興華,等.高效液相色譜法測(cè)定糧食制品中甲醛殘留量[J].分析試驗(yàn)室,2004,23(5): 74-76

[8]呂春華,陳笑梅,史穎珠,等.衍生液提取-高效液相色譜法快速測(cè)定香菇中的游離甲醛[J].色譜,2010,28(10):940-944

[9]隋雪燕,李雪梅,張宗雁,等.紡織品中游離甲醛的氣相色譜分析[J].分析化學(xué),2002,30(11):1333-1336

[10]陳笑梅,施旭霞,朱衛(wèi)建,等.高效液相色譜直接測(cè)定甲醛衍生物反應(yīng)條件的研究[J].分析化學(xué),2004,32(11):1421-1425

[11]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局. GB/T 21126-2007小麥粉與大米粉及其制品中甲醛次硫酸氫鈉含量的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2007:1-3

[12]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. NY/T 1283-2007香菇中甲醛含量測(cè)定[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2007:1-6

[13]中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)部. SC/T 3025-2006水產(chǎn)品中甲醛的測(cè)定[S].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社,2006:1-6

[14]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局. SN/T 1547-2011進(jìn)出口食品中甲醛的測(cè)定液相色譜法[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2011: 1-5

[15]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)總局. GB/T 2912-2009紡織品甲醛的測(cè)定[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2009:1-11

The Study of High-throughput Detection Method for Formaldehyde Residues in Food

PAN Hong-yan，GUO Qi-lei，SHI Hai-liang，YANG Hong-mei
（National Food Quality & Safety Supervision and Inspection Center，Beijing 100094，China）

Abstract：A rapid detection method was developed. The samples were addition with 2，4 -dinitrophenylhydrazine under acidic conditions，detected by HPLC UV detector. The mobile phase was acetonitrile∶water（6∶4，mL/mL），at a pump flow rate of 1.0 mL/min，detection wavelength of 355 nm. Under the optimal conditions，the linear range of formaldehyde was 0.05 μg/kg-5.0 μg/kg with correlation coefficient higher than 0.999 9，the limit of quantification was 0.5 mg/kg，the mean recoveries were 80.2 %-107.7 %. This method was simple，rapid and suitable for most food matrices such as flour，vermicelli，shrimp，bamboo shoots，yuba，fish（Carp，Squid etc），blood tofu etc.

Key words：formaldehyde；HPLC；food

收稿日期：2014-09-09

作者簡(jiǎn)介：潘紅艷（1986—），女（漢），助理工程師，碩士研究生，研究方向：食品安全。

基金項(xiàng)目：公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)項(xiàng)目（2012104003-2）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.037