朱文君，張曉燕，吳斌，沈崇鈺，丁濤，陳惠蘭（江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇南京210001）

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蜂膠中四環(huán)素族藥物殘留檢測(cè)方法研究

朱文君，張曉燕，吳斌，沈崇鈺，丁濤，陳惠蘭
（江蘇出入境檢驗(yàn)檢疫局動(dòng)植物與食品檢測(cè)中心，江蘇南京210001）

摘要：蜂產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的檢測(cè)技術(shù)日趨成熟，蜂膠作為蜂產(chǎn)品的重要組成部分，其抗生素的檢測(cè)方法有待進(jìn)一步的研究和發(fā)展。通過(guò)分析比較提取液、內(nèi)標(biāo)的選擇對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的影響，確定試驗(yàn)方法的線性范圍和定量限，建立的高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用法，回收率在74.1 %到118.8 %之間，精密度在15 %以下，能夠滿足蜂膠產(chǎn)品中四環(huán)素藥物殘留的日常檢測(cè)。

關(guān)鍵詞：蜂膠；四環(huán)素族藥物；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用

蜂產(chǎn)品包括蜂蜜、蜂膠、蜂花粉、蜂蠟、蜂王漿等幾類[1]，蜂膠是工蜂從植物體上采集的樹(shù)脂與上顎腺的分泌物和蜂蠟等形成的膠狀混合物，主要用于涂抹蜂巢裂縫和防止蜂巢內(nèi)的尸體腐爛，是蜜蜂用于維護(hù)群體健康的有效物質(zhì)，被譽(yù)為“紫色黃金”，具有抗菌消炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、加速組織愈合的作用，同時(shí)可用于高脂血癥和糖尿病的輔助治療。因其特殊的醫(yī)療保健功能，蜂膠越來(lái)越受到食品、保健品、化妝品、醫(yī)藥行業(yè)及廣大消費(fèi)者的關(guān)注[2-3]。

四環(huán)素族抗生素（Tetracyclines，TC s）是最早用于治療美洲腐臭幼蟲(chóng)病的抗生素之一，目前常用的主要包括四環(huán)素（Tetracycline，TC）、土霉素（Oxytetracycline，OTC）、金霉素（Chlortetracycline，CTC）等[4-5]，在養(yǎng)蜂過(guò)程中休藥期不夠長(zhǎng)以及藥物用量較大等會(huì)引起四環(huán)素族藥物在蜂產(chǎn)品中殘留。由于TCs易在骨骼和牙齒中沉積，導(dǎo)致牙齒持久染色（四環(huán)素牙）；也可在肝組織中富集，造成肝損害，特別是其結(jié)構(gòu)中含有多個(gè)活性基團(tuán)，可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，從而導(dǎo)致耐藥菌株的產(chǎn)生。

目前關(guān)于蜂蜜和蜂王漿等兩種蜂產(chǎn)品中四環(huán)素族抗生素檢測(cè)方法的報(bào)道比較多，目前的檢測(cè)方法有酶聯(lián)免疫法[6]、毛細(xì)管電泳法、薄層色譜法、液相色譜法[7]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[8-10]。酶聯(lián)免疫試劑盒適用于大批量樣品的篩查，但存在假陽(yáng)性無(wú)法進(jìn)行確證的問(wèn)題。由于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法抗干擾能力強(qiáng)，前處理也簡(jiǎn)單，已成為檢測(cè)蜂蜜、蜂王漿中四環(huán)素族藥物最常見(jiàn)的方法。我國(guó)關(guān)于蜂膠中獸藥殘留檢測(cè)的文獻(xiàn)較少，遠(yuǎn)不足以保障蜂膠的食用安全性。因此，迫切需要建立蜂膠中四環(huán)素族抗生素檢測(cè)方法。

1　材料與方法

1.1儀器和設(shè)備

Thermo Finnigan Surveyor液相色譜系統(tǒng)和TSQVantage串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜儀，配有電噴霧離子源（Electron Spray Ionization，ESI）；2-16PK離心機(jī)：德國(guó)Sigma公司；N-EVAPTM111氮吹儀：美國(guó)Organomation Associates公司；超純水器：MILLIPORE公司；固相萃取柱OASIS HLB 3 mL/60 mg。

1.2試劑與溶液

甲醇、乙腈（色譜純）：德國(guó)Merck公司；甲酸（色譜純）：德國(guó)CNW公司；檸檬酸、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙二胺四乙酸二鈉（分析純）：南京化學(xué)試劑廠；四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、地美環(huán)素和甲烯土霉素標(biāo)準(zhǔn)品（純度≥95 %）：Dr. Ehrenstorfer。

Mcllvaine緩沖溶液（0.1 mol/L）：稱取21.0 g檸檬酸，用水溶解并稀釋至1 000 mL混勻；稱取28.4 g磷酸氫二鈉，用水溶解并稀釋至1 000 mL混勻；將1 000 mL上述檸檬酸溶液與625 mL磷酸氫二鈉溶液混合，必要時(shí)用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH＝4.0±0.05；準(zhǔn)確稱取60.5 g的乙二胺四乙酸二鈉加入緩沖溶液中使其溶解搖勻。

1.3標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

1.3.1標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

稱取四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素、地美環(huán)素和甲烯土霉素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇溶解并定容至10 mL，配成1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于0℃～4℃保存。

1.3.2工作儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確吸取一定量四環(huán)素、土霉素、金霉素和強(qiáng)力霉素1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈-水（1∶1，體積比）逐級(jí)稀釋到1.0 μg/mL混合工作溶液，于0℃～4℃保存；準(zhǔn)確吸取一定量地美環(huán)素和甲烯土霉素1.0 g/L標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用乙腈-水（1∶1，體積比）稀釋到1.0 μg/mL作為內(nèi)標(biāo)溶液，于0℃～4℃保存。

1.3.3標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

吸取50 μL內(nèi)標(biāo)溶液及一定量的1.0 μg/mL混合工作溶液，配成2、5、10、20、50、100.0 ng/mL系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4儀器及色譜——質(zhì)譜條件

HPLC條件：Agilent Polaris C-18色譜柱（100 mm× 2.0 mm，5 μm）；流動(dòng)相：A. 0.1 %甲酸水溶液，B.甲醇；梯度洗脫程序：0～1.0 min10 %B，3.0 min～4.0 min，30 % B；6.0 min～9.0 min 90 %B，9.1 min～11.0 min 10 %B；流速：0.25 mL/min；柱溫為室溫，進(jìn)樣體積為25 μL。

MS/MS條件：采用ESI源，正離子方式檢測(cè)；離子源溫度：350℃；噴射電壓：2 500 V；鞘氣（Sheath Gas）55 arb，輔助氣（Auxiliary Gas）10arb；其他質(zhì)譜條件見(jiàn)表1。

表1目標(biāo)物及內(nèi)標(biāo)的質(zhì)譜條件Table 1 MS/MS parameters of object and internal standard

1.5方法

1.5.1樣品提取方法

稱?。?+0.05）g待測(cè)蜂膠樣品于50 mL塑料離心管中，加入50 μL美他環(huán)素、地美環(huán)素混標(biāo)做內(nèi)標(biāo)，加入四環(huán)素類混標(biāo)溶液做外標(biāo)，加入15 mL Mcllvaine緩沖液，分別在渦旋混勻器快速混勻2 min，高速離心，上清液過(guò)濾至玻璃管中。

1.5.2樣品純化方法

取Oasis HLB柱，常壓條件下首先用3 mL甲醇活化，待柱內(nèi)甲醇流干之后，用3 mL去離子水洗滌，去離子水流干后，將玻璃管中的經(jīng)過(guò)濾的均勻溶樣液加到柱內(nèi)，待測(cè)溶液完全流過(guò)Oasis HLB后，用5 mL去離子水洗柱，棄去全部流出液，在65 kPa的負(fù)壓下，減壓抽干10 min，最后用5 mL甲醇溶液洗脫。收集洗脫液于10 mL試管中。于40℃水溶液中氮?dú)獯抵两?。試管從氮吹裝置取出后，用1 000 μL甲醇水（甲醇與水的體積比為3∶7）溶液溶解。樣液經(jīng)過(guò)0.45 μm的有機(jī)濾膜后，上液相色譜質(zhì)譜儀測(cè)定。

2　結(jié)果與討論

2.1樣品中四環(huán)素類抗生素提取液的選擇

四環(huán)素類抗生素在弱酸性溶液中相對(duì)穩(wěn)定，在酸性（pH＜2）、中性或堿性（pH≥7）條件下易發(fā)生降解，所以比較不同pH緩沖液的提取效果，主要選擇Mcllvaine緩沖溶液（pH4）、磷酸鹽緩沖液（pH5）和磷酸鹽緩沖液（pH6），由于四環(huán)素類抗生素容易與Ca2+、Mg2+、Fe2+等金屬離子發(fā)生螯合，所以在3種提取液中均加入了EDTA。在試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，隨著pH上升，蜂膠粉經(jīng)提取后得到的提取液顏色也逐漸加深，4種化合物的回收率見(jiàn)圖1。由圖1可知，采用Mcllvaine緩沖溶液時(shí)4種目標(biāo)物的回收率最高，所以選擇了Mcllvaine緩沖溶液作為提取液。

2.2內(nèi)標(biāo)的選擇

4種目標(biāo)物與2種內(nèi)標(biāo)的色譜出峰時(shí)間及相對(duì)豐度見(jiàn)圖2。

圖1不同pH提取液的回收率Fig.1 Recovery of the different pH

圖2（a）標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖；（b）蜂膠加標(biāo)樣品色譜圖Fig.2（a）Chromatorams of standard solution；（b）Chromatorams of propolis spiked

由圖2可以看出，四環(huán)素類抗生素的絕對(duì)回收率為20 %～50 %，表明在前處理過(guò)程中有部分損失，而引入同位素內(nèi)標(biāo)是校正前處理?yè)p失的較好選擇。由于常用四環(huán)素族藥物主要是由不同鏈霉菌的培養(yǎng)液中提取獲得或者是再經(jīng)過(guò)半合成得到的，目前尚沒(méi)有同位素內(nèi)標(biāo)，所以采用結(jié)構(gòu)及性質(zhì)類似的物質(zhì)作為內(nèi)標(biāo)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以地美環(huán)素作為金霉素和強(qiáng)力霉素的內(nèi)標(biāo)，以甲烯土霉素作為四環(huán)素和土霉素的內(nèi)標(biāo)，均可以使目標(biāo)化合物獲得滿意的回收率。

2.3方法的線性范圍和定量限

配制質(zhì)量濃度為10 μg/L～200 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以目標(biāo)物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（y）為縱坐標(biāo)，目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x，μg/kg）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表2。

表2四環(huán)素、土霉素、金霉素及強(qiáng)力霉素的線性方程及相關(guān)系數(shù)Table 2 Linear equation and correlation coefficient

在蜂膠粉樣品中添加四環(huán)素族藥物標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照1.4的方法進(jìn)行前處理，并對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析，確定方法的定量限為20 μg/kg。

2.4回收率的結(jié)果分析

選取陰性蜂膠樣品，添加4種四環(huán)素族化合物標(biāo)準(zhǔn)品，添加水平分別為20、40和100 μg/kg，每個(gè)水平做6個(gè)平行，用內(nèi)標(biāo)法定量，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3回收率和精密度數(shù)據(jù)（n=6）Table 3 Recovery and precision（n=6）

可以看出，方法的平均回收率在74.1 %到118.8 %之間，精密度在15 %以下，滿足日常分析的需要。

3　結(jié)論

試驗(yàn)建立一種檢測(cè)蜂膠中四環(huán)素、土霉素、金霉素、強(qiáng)力霉素的液質(zhì)聯(lián)用新方法。采用Mcllvaine緩沖溶液提取蜂膠中的四環(huán)素殘留，以結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似的地美環(huán)素和甲烯土霉素作為4種四環(huán)素類目標(biāo)物的內(nèi)標(biāo)，確定了試驗(yàn)方法的線性范圍和定量限。試驗(yàn)結(jié)果顯示，平均回收率在74.1 %到118.8 %之間，精密度在15 %以下，重現(xiàn)性好。該試驗(yàn)方法可以滿足蜂膠產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物殘留的日常檢測(cè)工作。

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Researches of Detection for Tetracycline Drugs in Propolis

ZHU Wen-jun，ZHANG Xiao-yan，WU Bin，SHEN Chong-yu，DING Tao，CHEN Hui-lan
（National Honey Reference Laboratory，Animal，Plant and Food Inspection Center（APFIC）of Jiangsu Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau，Nanjing 210001，Jiangsu，China）

Abstract：The detection technology of tetracycline drugs in bee products has become mature increasingly. As an important part of bee products，the analytical method in propolis needs to be developed and researched. In this article，we choose different extract and internal standard，the experimental results are different. A linear range and quantitative restrictions were determined by the experiment. The recovery rate was between 74.1 % to 118.8 %，the precision of under 15 %.By high performance liquid chromalogphy-tandem mass spechomethy，the detection of tetracycline drugs residues can be satisfied in propolis.

Key words：propolis；tetracycline drugs；liquid-mass spectrometry

收稿日期：2014-09-28

作者簡(jiǎn)介：朱文君（1986—），女（漢），工程師，碩士，主要從事蜂產(chǎn)品中獸藥殘留的檢測(cè)工作。

基金項(xiàng)目：國(guó)家質(zhì)檢總局科研基金項(xiàng)目（2012IK167）

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.03.035